Funciones del moco olfativo humano y la edad.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 971 (2023) Citar este artículo

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Los olores son detectados por las neuronas sensoriales olfativas, que están cubiertas por moco olfativo. A pesar de la existencia de estudios sobre el moco olfativo, sus componentes, funciones y variabilidad interindividual siguen siendo poco conocidos. Aquí, describimos un estudio humano que combinó la colección de moco olfativo y pruebas psicofísicas olfativas. Nuestros análisis revelaron que el moco olfativo contiene altas concentraciones de solutos, como proteínas totales, elementos inorgánicos y moléculas para el metabolismo de xenobióticos. Las altas concentraciones dan como resultado una capacidad para capturar o metabolizar un repertorio específico de odorantes. Proporcionamos evidencia de que el metabolismo de los olores modifica nuestro sentido del olfato. Finalmente, la cantidad de moco olfativo disminuye de manera dependiente de la edad. Un experimento de seguimiento recapituló la importancia de la cantidad de moco en la detección sensible de olores por parte de sus receptores. Estos hallazgos brindan una imagen completa de los procesos moleculares en el moco olfativo y proponen una posible causa de la disminución del olfato.

La información sobre los olores se utiliza para detectar peligros, seleccionar y probar alimentos, y reconocer y comunicarse con otras personas. Una capacidad olfativa disminuida aumenta el riesgo de peligro personal y se asocia con disminución del apetito, problemas físicos y mentales y, en última instancia, una menor calidad de vida (QOL)1,2. La importancia del olfato se ha destacado aún más por la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019, ya que la afección con frecuencia causa disfunción olfativa3. La función olfativa suele disminuir con el envejecimiento y con el desarrollo de trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer4. Los casos de disminución del olfato relacionados con la edad también se han disparado en nuestra sociedad cada vez más envejecida. Es necesario comprender los mecanismos moleculares subyacentes a la disfunción olfativa para desarrollar una estrategia de tratamiento eficaz.

Los olores inhalados alcanzan la hendidura olfativa (OC) en la parte superior de la cavidad nasal. Las neuronas sensoriales olfativas (OSN) dispersas en el OC detectan olores utilizando aproximadamente 400 receptores olfativos (OR) y transmiten información sobre olores a áreas superiores del cerebro a través del bulbo olfatorio5. Además, la evidencia emergente sugiere que es probable que ocurra un proceso importante antes de que los OR reconozcan los olores. El OC de los mamíferos está cubierto por una fina capa de moco olfatorio secretado por las glándulas de Bowman y las células sustentaculares6. El moco olfativo contiene varios componentes que incluyen proteínas de unión a olores (OBP), enzimas metabólicas y elementos bioinorgánicos7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Debido a la capacidad de estos componentes para interactuar con los odorantes, juegan un papel importante en el olfato eficiente en los seres humanos mediante el transporte de volátiles a los sitios de unión de odorantes de los OR o mediante el metabolismo enzimático de los odorantes en estructuras no tóxicas y/o estructuras con mayor afinidad por OR. Un flujo continuo de mucosidad puede asegurar un lavado eficiente de la mucosa y la eliminación constante de los olores, lo que constituye un paso crítico en la recuperación de la sensibilidad después de la exposición a los olores22. La evidencia directa de las funciones del moco olfativo y su importancia en la percepción es rara debido a la dificultad de tomar muestras de suficiente moco olfativo puro para los análisis. Algunos estudios han obtenido moco olfatorio en forma de solución salina de una cavidad nasal irrigada, provocando dilución e incluyendo impurezas de las regiones circundantes7,8. Aunque otros han recolectado directamente muestras de moco olfativo puro de participantes humanos, solo han informado información limitada sobre sus funciones9,10,11,13,14.

El deterioro del olfato relacionado con el envejecimiento está generalizado en la población ≥ 65 años, sin tratamiento establecido. Esta disminución se ha informado en varios aspectos de las habilidades olfativas, incluida la sensibilidad, la discriminación, la identificación y la recuperación de la adaptación23,24,25,26. Se han propuesto algunas posibles causas del olfato envejecido27. La degeneración del neuroepitelio dependiente de la edad, incluidas las anomalías de las células basales, se ha observado sistemáticamente en modelos animales y en humanos28,29,30,31,32. Esta degeneración conduce a una disminución del número de NSO y provoca cambios atróficos en el bulbo olfatorio33,34. Un estudio anterior sugirió cambios relacionados con la edad en el nivel de expresión de ORs35, aunque otro estudio indicó que tenían un patrón de expresión estable durante el envejecimiento36. Los cambios en las regiones superiores del cerebro están implicados en los déficits funcionales relacionados con la edad37. Sin embargo, la contribución de estos cambios a la disminución del olfato sigue sin estar clara. Realizamos un estudio de asociación entre la disminución de la sensibilidad olfativa relacionada con la edad y el proteoma del moco olfativo10. Aunque se encontró que varias proteínas estaban asociadas con la sensibilidad olfativa, ninguna parecía estar involucrada directamente en la detección de olores a los que las personas mayores tienen una menor sensibilidad. Por lo tanto, la principal causa de los déficits en el olfato relacionados con la edad sigue sin determinarse.

Este estudio aclaró las funciones del moco olfativo humano y sus cambios dependientes de la edad. Realizamos un estudio que combinó la recolección de moco olfativo puro con pruebas olfativas. También realizamos experimentos de seguimiento in vitro e in vivo para explicar las asociaciones funcionales observadas.

Hay una falta de descripción de las propiedades y funciones básicas del moco olfativo puro en humanos. Recolectamos moco olfativo directamente de 30 participantes sanos sin quejas sensoriales de 20 a 67 años. Tras la instilación de lidocaína tópica, se colocó una almohadilla neuroquirúrgica en el surco olfatorio entre el cornete medio y el tabique nasal superior (OC, fig. 1a) y entre el cornete inferior y el tabique nasal inferior (INM) bajo visualización directa con endoscopio. Después de 5 min, se recogió el moco olfativo absorbido por las almohadillas y se sometió a análisis posteriores.

Propiedades básicas y variabilidad individual del moco olfativo. (a) Dibujo esquemático de la cavidad nasal humana que muestra la ubicación de la mucosidad muestreada en este estudio. Se recogieron muestras de moco de la hendidura olfativa (OC) y meato nasal inferior (MNI). (b) Distribución y valor medio (línea horizontal roja) de la cantidad de moco nasal recolectada de 30 participantes. Cada punto representa la cantidad promedio de mucosidad de las fosas nasales izquierda y derecha de un sujeto. (c) Dependencia del clima de la cantidad de moco INM recolectado. La cantidad de moco INM se normalizó a la cantidad de moco OC. Los diagramas de bigotes muestran la mediana, el primer y el tercer cuartil y los límites superior e inferior en los grupos de clima lluvioso (n = 6) y clima soleado (n = 24). ( d ) Distribución de la concentración de proteína total en el moco OC (n = 30), moco INM (n = 29) y saliva (n = 30). ( e ) Correlación entre la cantidad y la concentración de proteína en el moco OC (n = 30). ( f – i ) Distribución de las concentraciones de Mg, Fe, Cu y Zn en el moco OC (n = 29), moco INM (n = 29) y saliva (n = 30). No se detectó ion Cu en la saliva. ( j ) Enriquecimiento de Zn específico para mujeres en el moco OC. Se grafica la concentración de Zn en la mucosidad de 14 participantes femeninos y 15 masculinos. ( k ) Concentración de glutatión total (tGSH), glutatión oxidado (GSSG) y glutatión reducido (rGSH) en el moco OC (n = 30). ( l ) Análisis de dosis-respuesta de la activación de células HEK293T que expresan OR2T11 contra 0, 1 mM o 1 mM de terc-butil mercaptano (tBM) con concentraciones crecientes de CuCl2 suplementado en el medio de cultivo celular. Los datos se muestran como la media ± SE de tres experimentos independientes. También se analizaron las células transfectadas sin OR2T11 (simulacro). (m) No se encontró una asociación significativa entre la concentración de Cu en el moco OC y la puntuación del umbral olfativo (n = 28 participantes). La correlación de Spearman tampoco fue estadísticamente significativa (P > 0,05). La significación se evaluó con una prueba U de Mann-Whitney. *, p = 0,0255; **, p = 0,0043.

La cantidad de muestras de moco recolectadas difirió considerablemente entre los participantes y no siguió una distribución normal (P <0.01, prueba de normalidad de Shapiro-Wilk, Fig. 1b, Tabla complementaria 1). El peso de las muestras de moco OC varió de 7 a 144 mg (mediana, 36,9 mg) por cavidad nasal en 30 participantes, mientras que el moco INM varió de 0 a 135 mg (mediana, 45,2 mg). Estas variaciones no fueron causadas por problemas técnicos porque las cantidades de moco OC recolectadas de cada lado de la fosa nasal a través de procedimientos independientes se correlacionaron (rho de Spearman = 0,50, P < 0,01); esta conclusión también fue respaldada por la asociación significativa entre la cantidad de moco OC e INM obtenido de cada sujeto (rho de Spearman = 0.56, P <0.01, Fig. 1a complementaria), lo que sugiere que la variabilidad individual en la cantidad de moco recolectado fue causado por uno o más factores intrínsecos.

La variación individual en las cantidades de moco de INM se asoció con factor(es) intrínseco(s) y el factor ambiental de humedad en el día del muestreo. La cantidad de moco INM pareció ser menor cuando se recolectó en clima soleado (humedad relativa, 42 %) que en clima lluvioso (71–100 %), lo que sugiere deshidratación del moco INM (Figura complementaria 1b). Por el contrario, la cantidad de moco OC recolectado no difirió según el clima. La dependencia del clima del moco INM fue significativa cuando se analizó como valores normalizados con cantidades individualmente variadas de moco OC (Fig. 1c). Por lo tanto, la mucosidad INM es importante para humedecer el aire más seco inhalado antes de que alcance y deshidrate la mucosidad OC; de lo contrario, las funciones del moco OC se verán alteradas, como se ha informado en la mucosa traqueobronquial38. Mientras tanto, la independencia del clima sugiere que la variación individual en la cantidad de moco OC se atribuye principalmente a factores intrínsecos.

Ha habido poca descripción de las propiedades básicas del moco OC, especialmente las concentraciones de proteínas totales y elementos inorgánicos. En este estudio, primero determinamos la concentración de proteína total de los fluidos corporales muestreados utilizando un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) PierceTM (Fig. 1d). El moco OC contenía concentraciones de proteínas más altas que el moco INM o la saliva. En particular, la concentración de proteína del moco OC también varió considerablemente entre individuos, desde 6,2 a 20,8 mg/mL, y mostró una relación negativa con la cantidad recolectada de moco OC (Fig. 1e).

El alto metabolismo xenobiótico requiere una alta concentración de enzimas y elementos inorgánicos que constituyen sus centros activos. Las concentraciones de cuatro elementos bioinorgánicos traza (Mg, Fe, Zn y Cu) se cuantificaron con éxito en todas las muestras, excepto en el Cu de la saliva. Las concentraciones de otros cinco elementos, Al, Cr, Mn, Ni y Co, estaban por debajo del límite inferior de cuantificación (100 ppb para el moco OC e INM y 5 ppb para la saliva). En general, el moco OC contenía concentraciones más altas de elementos inorgánicos que el moco INM o la saliva, excepto Zn (Fig. 1f-i). La concentración de Zn no difirió entre el moco OC e INM y mostró un enriquecimiento específico de la hembra (Fig. 1j). De acuerdo con el propósito del metabolismo y la desintoxicación de xenobióticos, detectamos concentraciones individualmente variadas de un antioxidante de bajo peso molecular, glutatión39, en el moco OC (Fig. 1k). La concentración de glutatión se correlacionó con la concentración de Fe (Figura complementaria 1c). Se detectaron concentraciones similares de glutatión en una mezcla de cantidades iguales de moco INM de los participantes: 163 μM de glutatión oxidado (GSSG) y 23 μM de glutatión reducido (rGSH). Por el contrario, la saliva no mostró niveles detectables de glutatión.

La alta concentración de Cu en el moco OC fue notable incluso cuando se comparó con la del suero (concentración media: 4,8 ppm (75 μM) en moco OC frente a 1,1 ppm en suero), pero similar a la del moco OC de ratón estimada por midiendo líquido de lavado nasal (42 μM)15,40. Este resultado parece ser razonable dado que las OSN utilizan Cu para la detección sensible de olores azufrados15. La concentración de Cu en el moco de OC osciló entre 12,6 y 189 μM, similar al rango de concentración efectivo para mejorar la capacidad de respuesta de las células que expresan OR a un compuesto de azufre, terc-butil mercaptano (tBM; Fig. 1l)41. Sin embargo, esta variable no explicó la variación individual en la sensibilidad olfativa a tBM (Fig. 1m). Esta discrepancia sugiere: (1) una limitación metodológica para discriminar iones de Cu unidos a proteínas e iones de Cu libres; y (2) la presencia de factores más dominantes, como la variación genética de los OR que detectan olores azufrados, como se sugirió anteriormente42.

Se ha propuesto un aspecto funcional importante del moco OC basado en las funciones de los OBP. Se ha considerado que el propósito de su capacidad de unión de olores es solubilizar eficientemente los olores hidrofóbicos y entregarlos a los OR9,22,43,44. Sin embargo, esto se basa únicamente en análisis in vitro utilizando OBP producidos artificialmente; por lo tanto, se desconoce si el propio moco OC tiene esta capacidad y contribuye a la percepción olfativa de los odorantes ligados.

Al menos dos supuestas OBP se expresaron en el moco olfativo humano, pero no se caracterizó su actividad de unión a olores. En este estudio, evaluamos la actividad de captura de olores del moco OC. Antes de investigar el moco OC, utilizamos la proteína 1 de unión a olor de Sus scrofa (pigOBP), una OBP de mamífero bien caracterizada, para establecer el experimento45,46. En primer lugar, la pigOBP recombinante purificada se sometió a un ensayo de unión competitiva bien establecido utilizando el ligando de fluorescencia 1-aminoantraceno (1-AMA)44,45,46. Se confirmó el resultado de un estudio previo en el que la fluorescencia de pigOBP y el complejo 1-AMA se extinguió tras la unión de un ligando conocido, citronelol (Fig. 2a-c)46. Usando este ensayo de unión, se identificaron ambrettolide (Amb) y l-mentona como nuevos ligandos con una mayor afinidad por pigOBP (Fig. 2b, c). Como el ensayo de unión competitiva requiere una gran cantidad de moco OC para probar múltiples odorantes, se empleó un tipo diferente de experimento. La solución de pigOBP se preparó en un vial de vidrio y se mezcló con tres ligandos (Fig. 2d). La cantidad de ligandos liberados de la solución de pigOBP en el espacio de cabeza se absorbió y se midió mediante microextracción en fase sólida (SPME) seguida de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC/MS). Los ligandos con una mayor afinidad por pigOBP en el ensayo de unión competitiva mostraron una liberación más lenta, lo que resultó en concentraciones más bajas en el espacio de cabeza (Fig. 2e, f). La liberación más lenta fue causada por la propiedad de captura de olores de pigOBP, ya que fue bloqueada por la adición del ligando competitivo 1-AMA (Fig. 2g). Estos datos validaron el experimento para evaluar la actividad de captura de olores de las muestras de moco en función de la cantidad de olor en el espacio de cabeza.

Propiedad de captura de olores del moco olfativo. ( a ) Ensayo de unión competitiva para pigOBP a odorantes. Los datos representan la fluorescencia del vehículo (Tris-HCl), pigOBP 10 μM, 1-AMA 1 μM y su mezcla. ( b ) Cambio en la fluorescencia cuando el complejo pigOBP-1-AMA se expuso a concentraciones crecientes de odorantes. La fluorescencia se normalizó utilizando los valores del vehículo y la mezcla de pigOBP y 1-AMA. Barras de error, desviación estándar sobre tres repeticiones. (c) Estructuras químicas de los odorantes. ( d ) Procedimiento experimental para la cuantificación de la capacidad de unión de odorantes en función de las concentraciones de odorantes en el espacio de cabeza. ( e, f ) Capacidad de captura de olores de pigOBP. Se extrajeron tres olores emitidos por la solución de pigOBP y se analizaron con SPME-GC/MS. (e) pigOBP redujo la liberación de odorantes de una solución de una manera dependiente de la dosis y la afinidad. ( f ) Propiedades de captura de olores de 30 μM pigOBP dependiendo de la concentración de olor. ( g ) Adición de liberación de olores inducida por 1-AMA de la solución pigOBP. Los datos se muestran como porcentaje del área del pico, donde el área del pico detectada de la solución odorante sin pigOBP se estableció en 100 %. ( h ) Variación individual de la capacidad de captura de olores del moco OC. Concentración relativa en el espacio de cabeza de odorantes emitidos a partir de moco OC diluido × 10. Se añadieron odorantes con etanol hasta una concentración final de 500 µM. El área del pico de cada odorante sin moco OC se fijó al 100 % después de la normalización con el área del pico de etanol. (i) Dependencia de la concentración de olor de la capacidad del moco OC. Concentración relativa en el espacio de cabeza de odorantes emitidos a partir de moco OC diluido × 10 (5–500 μM para concentraciones finales). ( j ) Correlación de la capacidad de captura de olores y la concentración de proteínas del moco OC (n = 28). ( k ) Asociación entre la capacidad de captura de olores y la sensibilidad perceptiva a Amb. OBP, proteína fijadora de olores; PEA, alcohol feniletílico.

Se investigaron las propiedades de captura de olores de una mezcla de volúmenes iguales de moco OC obtenido de 30 participantes. Se probaron los siguientes tres odorantes: (1) Amb, que tiene la mayor afinidad por pigOBP; (2) muscone, una fragancia importante debido a su calidad de olor superior; y (3) alcohol feniletílico (PEA), el odorante más común utilizado para la investigación olfativa debido a su pequeño efecto trigémino47. Las concentraciones en el espacio de cabeza de los tres odorantes fueron marcadamente más bajas cuando se mezclaron con el moco OC que con el moco INM, la saliva o la solución salina, aunque no pudimos producir las réplicas del ensayo requeridas para el análisis estadístico debido a la cantidad limitada de muestras recolectadas (Fig. 2). La capacidad seguía siendo clara para Amb y mostraba variabilidad individual incluso cuando el moco OC se aplicaba a una dilución de diez veces (Fig. 2h). Esta liberación lenta dependía de la concentración de Amb mezclada con moco OC, de acuerdo con las características observadas de pigOBP (Fig. 2i). Podemos excluir la posibilidad de que la menor concentración de Amb en el espacio de cabeza fuera causada por la descomposición en el moco OC. Esto se debe a que la Amb que quedaba en el moco del OC fue detectable cuando se extrajo con un solvente orgánico y se analizó por GC/MS (81 % de Amb extraída de solución salina). La propiedad de captura de Amb se correlacionó positivamente con la concentración de proteína en el moco OC (Fig. 2j).

Luego investigamos si la actividad de captura de olores del moco OC está asociada con la percepción, y los resultados mostraron que no fue un determinante para la detección sensible de Amb porque no se observó correlación entre ellos (Fig. 2k). Los dos participantes cuyo moco OC carecía por completo de la actividad de captura de Amb mostraron una puntuación de sensibilidad perceptiva promedio en comparación con 30 participantes (7,5 y 3, entre 0 y 15; puntuación promedio: 4,9). En resumen, este estudio proporciona evidencia de que el moco OC humano exhibe una capacidad significativa de unión a olores no asociada con la sensibilidad olfativa.

A continuación, describimos la capacidad metabólica del moco OC humano y sus variaciones individuales. En primer lugar, se seleccionaron seis odorantes para nuestros experimentos porque se informó que se metabolizaban en muestras relacionadas con el moco de OC (ésteres: acetato de p-cresilo [pCA] 1 y acetato de trans-2-hexenilo 15; aldehídos: benzaldehído 23 y octanal 25; cetonas: 2′-metoxiacetofenona 28 y acetofenona 30)7,20,48,49. Estos odorantes se mezclaron con el moco OC recolectado (una mezcla de cantidades iguales de todos los participantes), y sus extractos de acetato de etilo se analizaron usando GC/MS. Los resultados mostraron que el moco OC indujo los siguientes metabolismos: hidrólisis de los ésteres que producen p-cresol 2 (99 % como índice de abundancia máxima del metabolito en el cromatograma de iones totales (TIC)) y trans-2-hexenol 16 (16 %); y reducción y oxidación de los aldehídos que producen alcohol bencílico 24 (51 %), octanol 26 (33 %) y ácido octanoico 27 ​​(50 %; Fig. 3a–d, Fig. 3a complementaria). Sin embargo, no se detectaron metabolitos derivados de las dos cetonas, 2′-hidroxiacetofenona 29 y salicilato de metilo 31, aunque se ha informado en el OC50 la expresión génica de CYP que las oxida.

Actividad enzimática del moco olfativo. ( a - d ) Supuesta actividad enzimática del moco de la hendidura olfativa (OC) y la detección de los metabolitos resultantes. Los odorantes se incubaron en solución salina o moco OC. El reactivo se extrajo usando acetato de etilo y se analizó usando cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS). La intensidad de los picos de iones totales o de iones extraídos se normalizó a un área de pico del éster 19, que no experimentó conversión mediada por moco de OC. Las barras grises y azules representan intensidades iónicas totales normalizadas de 20 000 y 2000, respectivamente. La barra amarilla representa una intensidad de iones extraídos de 50. (e) Comparación de la actividad enzimática del moco OC con moco y saliva del meato nasal inferior (INM). Las cantidades de producto en cada conversión enzimática se presentan como valores normalizados, donde un área máxima de metabolito en moco OC se establece en 100%. ( f ) Diferencia individual en la actividad enzimática del moco OC y su asociación con la concentración de proteína. La actividad esterasa de moco individual × 10 OC se evaluó en función de una tasa de conversión como [p-cresol (mol)]/([pCA (mol)] + [p-cresol (mol)]) 5 min después de acetato de p-cresilo ( pCA) se aplicó al moco OC (n = 29). ( g ) Asociación entre la actividad de esterasa y la concentración de carboxilesterasa 1 (CES-1) en el moco OC (n = 29). Las líneas verde y magenta indican valores medios de moco INM y OC, respectivamente. ( h ) Selectividad de sustrato de moco OC y CES-1. El CES-1 recombinante no mostró una reactividad idéntica con el moco OC. El moco OC mostró actividad residual bajo los inhibidores de CES (fosfato de bis (4-nitrofenil)), que inhibía completamente CES-1. La variabilidad entre muestras del área máxima detectada se corrigió utilizando el área máxima del éster 19 no metabolizado. (i) Curso temporal de la tasa de conversión de pCA a p-cresol en moco OC diluido × 10 o solución CES-1. La reacción prosiguió linealmente hasta 5 minutos después de la adición de pCA en el moco de OC diluido diez veces y hasta 40 minutos en la solución de CES-1. ( j ) Gráfico de Michaelis-Menten del metabolismo de pCA en moco OC diluido × 10 o solución CES-1. Se añadieron varias concentraciones de pCA y se midió la tasa de conversión en cada momento. ND, no detectado.

La notable capacidad del moco OC para la hidrólisis de ésteres nos llevó a investigar la relación estructura-actividad. Se llevó a cabo un experimento adicional para probar una serie de odorantes de éster, con pCA como control positivo (97 % como relación de abundancia máxima de metabolito de TIC). Los resultados demostraron que el moco OC convirtió ésteres fenólicos (acetato de 2-feniletilo 3 [43%], acetato de anisilo 5 [8%], acetato de cinamilo 7 [16%]), un éster cicloalifático (acetato de l-mentilo 9 [14% ]), y ésteres alifáticos (cis-3-hexenil acetato 11 [19%], citronelil acetato 13 [25%]; Fig. 3a). Por el contrario, los ésteres estéricamente impedidos (acetato de linalilo 17, acetato de terpinilo 19 y acetato de isobornilo 21) no se convirtieron. El metabolismo observado fue inducido de manera más prominente por el moco OC que por el moco INM o la saliva, de acuerdo con las concentraciones más altas de soluto en el moco OC (Fig. 3e, Fig. 3b complementaria).

A continuación, se analizó la variabilidad individual en la actividad esterasa del moco OC centrándose en la conversión de pCA en p-cresol. La comparación se realizó en base a una tasa de conversión de 5 min, ya que la reacción transcurrió linealmente hasta 5 min después de la adición de pCA (ver Fig. 3i). Un participante fue excluido de este análisis porque la cantidad de mucosidad recolectada fue insuficiente. Las tasas de conversión (relación molar) diferían considerablemente entre los participantes y oscilaban entre el 5 y el 45 %, con un valor medio del 18 %. La actividad de la esterasa se correlacionó negativamente con la cantidad de moco OC y se correlacionó positivamente con las concentraciones de varios componentes, como la proteína total (Fig. 3f, Tabla complementaria 1).

También se investigaron las moléculas que causan una alta actividad de esterasa en el moco OC. Se supuso que CES-1 contribuía a esta reacción en un estudio anterior con roedores7. Un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) mostró que la concentración de CES-1 era más alta en el moco OC que en el moco INM o en la saliva (concentración media: 5,73 μg/mL, 1,24 μg/mL y 0,06 μg/mL, respectivamente, Fig. 3g). Sin embargo, CES-1 no tuvo en cuenta completamente la actividad de esterasa en el moco OC. La concentración de CES-1 en el moco OC representó una menor variación individual en la actividad de esterasa que la concentración de proteínas totales (44% frente a 53%, Fig. 3f, g). Además, el moco de OC mostró diferentes selectividades de sustrato que la solución de CES-1 recombinante. El CES-1 recombinante no reconstituyó la reactividad del moco OC al acetato de anisilo 5 y al acetato de citronelilo 13 (Fig. 3h). Además, el moco OC mostró actividad residual bajo los inhibidores de CES bencilo y bis (4-nitrofenil) fosfato (BNPP), que inhibieron completamente las reacciones mediadas por una concentración igual de CES-1 recombinante (Fig. 3h, Suplementario Fig. 3c). Finalmente, una solución con una concentración equivalente de CES-1 recombinante mostró menos reactividad que el moco OC en el análisis de cinética enzimática (Fig. 3i, j). Estos resultados indicaron la presencia de otra(s) enzima(s) responsable(s) de la actividad enzimática.

Un estudio anterior informó que una baja tasa de conversión enzimática de un odorante en la saliva humana afectó levemente la percepción del olor8. Presumimos que la drástica actividad esterasa del moco OC tuvo un mayor efecto sobre la percepción del olor del sustrato. Realizamos un estudio sensorial utilizando un paradigma de adaptación olfativa basado en el estudio anterior8. La adaptación olfativa es un fenómeno ampliamente conocido de reducción de la sensibilidad específica del odorante después de una exposición prolongada a un odorante idéntico (Fig. 4a, b)51. En consecuencia, en el estudio actual, la sensibilidad olfativa al p-cresol disminuyó después de la exposición previa al p-cresol, mientras que no fue inducida por el olor prolongado a muscone (Fig. 4c, d). Por el contrario, la exposición previa a pCA indujo una reducción significativa en la intensidad perceptiva de su metabolito p-cresol, lo que sugiere que pCA se convierte en p-cresol en el moco OC. Una explicación alternativa para este resultado es que oler pCA indujo la desensibilización del OR, lo que desempeña un papel importante en el reconocimiento de p-cresol. Sin embargo, los resultados de nuestros ensayos in vitro descartaron esta posibilidad. Entre los 378 OR humanos probados expresados ​​en células HEK293T, se descubrió que OR9Q2 era el receptor más sensible para p-cresol (Fig. 4e, Fig. 4 complementaria). La caracterización funcional posterior mostró que OR9Q2 no era sensible a pCA (Fig. 4f, g). Por tanto, la razón por la que la adaptación con pCA es paralela a una adaptación excepcional con p-cresol es que la conversión de pCA en p-cresol se produce en la cavidad nasal. Sin embargo, aún no está claro si los humanos perciben una mezcla de metabolización de pCA y generación de p-cresol al oler pCA, debido a la falta de información sobre la cinética de reacción in vivo.

Efecto de la conversión enzimática sobre la percepción. (a, b) Un modelo que muestra la adaptación olfativa para p-cresol o acetato de p-cresilo (pCA) a través de la activación y desensibilización de un subconjunto distinto de receptores olfativos (OR). (c) El esquema de adaptación experimental y la evaluación sensorial. Cada sujeto evaluó la intensidad percibida de la primera botella y la tercera botella, las cuales contienen bolas de algodón saturadas con p-cresol. La segunda botella contenía un estímulo de adaptación: agua destilada (sin olor), p-cresol, muscone o pCA. Se pidió a los participantes que olieran p-cresol y registraran la intensidad percibida del olor en una escala de 95 mm, marcada desde ningún olor hasta un olor fuerte. ( d ) Cambio en la intensidad percibida de p-cresol después de una exposición prolongada con cada muestra de prueba (n = 8). Los cambios estadísticamente significativos en comparación con un control (sin olor) se determinaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía con desviación estándar desigual y la prueba de comparaciones múltiples de Holm-Sidak. *, p = 0,0303; **, p = 0,0012. ( e ) Detección de OR humanos para p-cresol. Cada uno de los 378 OR enumerados a lo largo del eje x se expresó en células HEK293T y se estimuló con p-cresol (1 mM). Las activaciones OR se monitorearon usando un ensayo de gen informador de luciferasa regulado por CRE. El eje y indica el aumento en veces de la actividad OR donde una señal de células estimuladas se divide por la de células no estimuladas que expresan el mismo OR (valores medios de dos réplicas de selección). ( f, g ) Imágenes de calcio de la activación de OR9Q2. ( f ) Un rastro de respuesta representativo de células sensibles. Las líneas verticales moradas alrededor del trazo representan la desviación estándar de 50 celdas. Las líneas horizontales por encima de la traza indican la duración de las estimulaciones con pCA 1 mM y p-cresol 0,3 mM. ( g ) Proporción de células que responden a 0, 3 mM o 1, 0 mM de cada odorante de tres experimentos independientes (media ± SE). ( h ) Curva de dosis-respuesta de la actividad transitoria del potencial receptor de melastatina 8 (TRPM8) con l-mentol y acetato de l-mentilo. Se midió la fluorescencia dependiente del flujo de entrada de iones de calcio en TRPM8 expresada de manera estable en células HEK293T. La intensidad de la fluorescencia se normalizó con ionomicina 4 μM. Los datos son de tres experimentos independientes (media ± SE).

Un olfateo en humanos dura de 1 a 2 s. Examinamos si la cinética de reacción de la conversión enzimática fue lo suficientemente rápida como para influir en la percepción dentro de un olfato. Dado que es difícil evaluar la generación de una cualidad de olor específica derivada únicamente de un producto mezclado con un sustrato, se utilizó como índice más claro una percepción somatosensorial familiar, es decir, el enfriamiento. Oler l-mentol 10 o su acetato, l-mentil acetato 9, provoca una sensación refrescante, que es claramente evaluable52. Lo más probable es que la sensación refrescante sea causada por la activación del receptor potencial transitorio de melastatina 8 (TRPM8) en las neuronas somatosensoriales53. En contraste con el l-mentol 10, el acetato de l-mentilo 9 no mostró actividad TRPM8 (Fig. 4h). Esta discrepancia presenta evidencia de la presencia de actividad de moco OC in vivo que metaboliza el acetato de l-mentilo 9 para producir l-mentol 10, como se demostró utilizando muestras de moco OC (Fig. 3a). Más importante aún, este resultado demuestra que la reacción de conversión enzimática es lo suficientemente rápida como para afectar la percepción del olor dentro de una inhalación. Por lo tanto, nuestra instantánea perceptiva de la naturaleza química fuera de la nariz es editada por el moco olfativo antes de que lo percibamos.

La sensibilidad olfativa generalmente disminuye con la edad. Como evaluamos a participantes más jóvenes (rango de edad: 20–67 años) que aquellos en estudios previos que mostraron una disminución significativa relacionada con la edad24,26, no se detectó una relación negativa entre la edad y la sensibilidad olfativa a dos odorantes (PEA y tBM) ( Figura complementaria 5). Por el contrario, el estudio actual encontró una reducción dependiente de la edad de la sensibilidad perceptiva a Amb (rho = − 0.45, P < 0.05, Fig. 5a). Este resultado indicó que nuestras muestras de moco OC se recolectaron de un grupo de participantes con disminución del olfato relacionada con la edad. Por lo tanto, fue posible identificar un factor candidato de las muestras de moco OC que mostró cambios dependientes de la edad y sensibilidad olfativa reducida.

Relación entre la disminución del olfato y el cambio en el moco de la hendidura olfativa con el envejecimiento. (a–f) Factores asociados con la edad. El eje x indica la edad de los participantes, y el eje y representa los valores de umbral olfativo para ambrettolide (Amb; a, n = 28), la cantidad de moco de la hendidura olfativa (OC) (b, n = 30), la cantidad de moco inferior moco del meato nasal (INM) (c, n = 30), concentración de proteína en el moco OC (d, n = 30), tasa de conversión de acetato de p-cresilo (pCA) a p-cresol en moco OC diluido × 10 (e , n = 29), y la concentración relativa en el espacio de cabeza de Amb emitida por el moco OC (f, n = 28). ( g ) Resumen gráfico de los cambios dependientes de la edad en el moco olfativo. El moco OC disminuyó en cantidad y aumentó en la concentración de componentes con el envejecimiento. ( h ) Procedimiento experimental para analizar la activación de células que expresan receptores olfativos (OR) cubiertas con diferentes cantidades de medio (0–50 μL), que imitan la disminución dependiente de la edad en la cantidad de moco OC. Se colocaron bolas de algodón saturadas con odorantes (100 μM) sobre las células en cada pocillo de la placa. ( i, j ) Respuesta de células que expresan cOR5A2 o OR9Q2 contra Amb o p-cresol que se difunde desde la fase de vapor. La respuesta se normalizó con la respuesta máxima en la condición de 50 μL. Cada línea muestra la respuesta promedio de tres experimentos independientes. Los tonos verticales representan errores estándar.

Se ha propuesto que varios factores relacionados con la edad podrían causar una disminución de la sensibilidad olfativa10,27,28,29,30,31,33,34,35,37. Sin embargo, todavía no hay ejemplos de explicaciones mecánicas que vinculen los cambios en estos factores candidatos con la disminución de la sensibilidad olfativa. Este estudio encontró nuevos cambios dependientes de la edad. La variabilidad individual antes mencionada en la cantidad de moco OC se correlacionó significativamente con la edad (rho = 0,66, P <0,001, Fig. 5b). Los participantes de edad avanzada mostraron una cantidad de moco OC un 60 % menor que los participantes más jóvenes (promedio: 59,1 ± 21,0 mg en participantes de 20 s vs. 23,5 ± 10,6 mg en participantes de 60 s). El moco INM también disminuyó de manera dependiente de la edad (rho = − 0.35, P = 0.056) y, por lo tanto, ya no funcionó lo suficiente como para humedecer el moco OC (Fig. 5c). Por el contrario, la concentración de proteína y la actividad enzimática aumentaron, lo que indica que las cantidades reducidas de moco OC fueron causadas por una disminución en el contenido de agua (Fig. 5d, e). A pesar del aumento relacionado con el envejecimiento en las concentraciones de proteínas totales en el moco OC, la actividad de captura de Amb no mejoró (Fig. 5f), probablemente debido a una disminución específica en los supuestos OBP y/o la existencia de otro(s) factor(es) desconocido(s). ) asociado a la actividad10.

El aumento de las concentraciones de soluto y la actividad enzimática con el envejecimiento pueden explicar el deterioro de las habilidades de identificación de olores frente a una gama restringida de odorantes como el azufre y los ésteres; sin embargo, no explica el deterioro de la sensibilidad olfativa frente a Amb (Fig. 5a) y otros odorantes generales. En cambio, es más probable que una disminución en la cantidad de moco OC explique la disminución de la sensibilidad olfativa a los olores generales debido al daño mediado por deshidratación en la bicapa lipídica de las OSN y la distorsión de las estructuras OR. Esto es consistente con estudios previos. Un estudio demostró que una cantidad reducida de moco olfativo en ratones disminuyó la sensibilidad olfativa54. Otro estudio informó que el aumento de la cantidad de moco en conejos recién nacidos resultó en una sensibilidad olfativa elevada16.

El estudio actual reconstituyó el efecto de una disminución en la cantidad de moco OC sobre la activación de OR en respuesta a los olores (Fig. 5g, h). A diferencia de una gran cantidad de estudios previos en los que se estimularon los odorantes en fase líquida8,15,19,41, las células HEK293T que expresan cada OR se presentaron con un odorante en fase de vapor, lo que nos permitió evaluar la activación de OR en condiciones más prácticas . Se colocó una bola de algodón saturada con una solución odorante sobre las células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Fig. 5h). Los olores volatilizados de la bola de algodón llegaron a las células que expresan OR a través del medio, y sus respuestas se monitorearon usando GloSensor™ en tiempo real. Se observó estimulación de la fase de vapor como lo indica el hallazgo de que no se observó respuesta cuando se probó un estimulante celular no volátil (es decir, forskoline). Se monitorearon las activaciones de una versión consenso de OR5A2 (en adelante, cOR5A2) y OR9Q2 frente a la fase vapor de Amb y p-cresol55. El resultado mostró que un bajo volumen de medio que cubría las células que expresaban OR provocaba una respuesta máxima más baja; una reducción del 60 % en la cantidad de medio (de 50 a 20 μL) disminuyó la amplitud de respuesta de cOR5A2 y OR9Q2 al 33 % y al 35 %, respectivamente (Fig. 5i, j). Este experimento no reconstituyó las propiedades físicas y bioquímicas del moco OC. La considerable toxicidad del moco OC para las células HEK293T dificultó el experimento en condiciones más fisiológicas. Por lo tanto, no podemos excluir la posibilidad de que las diferencias en las cantidades de moco de OC den lugar a efectos diferenciales en la activación de OR. No obstante, este es el primer estudio que propone un factor causante de la disminución de la sensibilidad olfativa dependiente de la edad con una posible explicación mecánica.

El presente estudio describió ampliamente las características del moco OC humano. El moco OC contiene concentraciones más altas de solutos, incluidas proteínas totales, elementos inorgánicos y glutatión, que otros fluidos corporales. Nuestros análisis funcionales brindan conclusiones con respecto a las funciones sugeridas anteriormente del moco OC y su contribución a la percepción del olor. El moco OC exhibe una notable capacidad de captura de olores, pero esto no explica la sensibilidad perceptiva a un olor. Además, el estudio actual encontró que el metabolismo de los olores en el moco OC está involucrado en la percepción. Finalmente, los presentes resultados demuestran una disminución dependiente de la edad en la cantidad de moco OC como una causa potencial de disminución relacionada con la edad en la sensibilidad olfativa.

Este estudio reveló las concentraciones de solutos en el moco OC y su variabilidad individual. Nuestros resultados proporcionan información esencial que explica las implicaciones previas de las funciones del moco de OC, como la capacidad de unión de olores, el alto metabolismo de xenobióticos y el reconocimiento de olores mediado por Cu9,41,43. Además, los datos actuales, junto con la composición proteica informada anteriormente, permiten la reconstitución del moco OC y ayudan a investigar la importancia funcional de las propiedades emergentes, incluido el Zn como elemento del bloque d y como una característica específica del sexo56,57. Las funciones asumidas del moco OC no se limitan al olfato e incluyen la protección de los OSN de compuestos nocivos y la prevención de infecciones. Los datos sin procesar divulgados proporcionarán una base para futuros estudios para comprender las funciones del moco olfativo desde múltiples perspectivas (Tabla complementaria 1).

La función más ampliamente asumida del moco OC es el transporte y la concentración de odorantes a través de OBP. De hecho, un estudio reciente probó la función potencial de un OBP humano en el reconocimiento de olores por parte de los OR; sin embargo, probaron un OBP producido artificialmente sin ligandos. Por lo tanto, la pregunta de si el moco OC tiene la capacidad de capturar olores y promover su detección quedó sin respuesta. Nuestros experimentos in vitro e in vivo concluyeron que el moco OC tenía una capacidad drástica de unión a olores; sin embargo, no explicaron la variación individual en la sensibilidad olfativa. Esto es consistente con los resultados de un modelo de insecto que puede responder a los olores con una sensibilidad comparable cuando se eliminan todos los genes OBP58. Especulamos que la actividad de captura de olores del moco OC puede contribuir a la rápida eliminación de olores del microambiente de las OSN para garantizar la recuperación de una adaptación prolongada y prevenir el daño causado por la acumulación de sustancias nocivas59.

Este estudio reveló varios metabolismos xenobióticos altos de moco OC con análisis cinético. Dos estudios recientes informaron las actividades enzimáticas de muestras derivadas de moco de OC humano contra odorantes seleccionados8,14; sin embargo, estos estudios evaluaron las muestras en condiciones artificiales. Un estudio obtuvo moco OC como una solución salina de una cavidad nasal irrigada, lo que probablemente provocó la dilución e inclusión de impurezas de las regiones circundantes, como el moco del meato nasal inferior (MNI)8. De hecho, este estudio no detectó una actividad enzimática relativamente más alta del moco OC. Otro estudio recolectó directamente la mucosidad de OC, pero la reducción de aldehído solo se detectó en la mucosidad de OC diluida suplementada con coenzimas14. El estudio actual probó el moco OC sin dilución ni ningún tratamiento e investigó su actividad contra una gama más amplia de odorantes. En particular, las diferencias individuales en la actividad enzimática se determinaron en función de la cinética de reacción, lo que proporciona información más precisa que una comparación informada anteriormente basada en mediciones de punto final8,14. Nuestros resultados demostraron que el moco OC intacto tiene una capacidad sobresaliente para la conversión de olores. Observamos que la menor capacidad del moco INM por unidad de masa que el moco OC probablemente contribuya significativamente a la percepción, dado que el moco INM proporciona un área de superficie más amplia para la conversión enzimática de los odorantes inhalados. Esta clarificación de capacidad puede permitir el diseño de un pro-odorante, que activa un OR solo después de lograr un nivel suficiente de conversión enzimática.

El hallazgo más importante de este estudio fue una disminución dependiente de la edad en la cantidad de moco OC. De acuerdo con nuestras observaciones, estudios previos han demostrado que el envejecimiento induce anomalías en la homeostasis del agua y da como resultado una mucosidad más delgada, con una función deteriorada en otros tejidos60,61,62. Se observó degeneración relacionada con la edad de las glándulas de Bowman y secreción de moco en la cavidad nasal28. La disminución en el contenido de agua y el aumento en las concentraciones de soluto probablemente no solo causan la disfunción de las OSN mediada por la sequedad, sino que también conducen a un aumento en la viscosidad de la capa de moco. Esto reduce la velocidad de difusión de los odorantes absorbidos y, en consecuencia, empeora la eficiencia de detección de las moléculas de odorantes por parte de las OSN. Se sabe que un aumento en la concentración de moco (es decir, deshidratación) disminuye la velocidad del flujo de moco y elimina sustancias, incluidos los olores63,64. La eliminación más lenta y la disminución del volumen de mucosidad pueden aumentar sinérgicamente la acumulación de volátiles dañinos y microorganismos infecciosos, lo que daña el neuroepitelio y las glándulas de Bowman, lo que resulta en la aceleración de la senescencia. La presente evidencia sugiere que la recuperación de agua en el moco OC puede ser un tratamiento eficaz para la disfunción olfativa, una causa de deterioro de la calidad de vida en los ancianos.

Los participantes fueron reclutados por muestreo de bola de nieve y fueron compensados. Treinta adultos japoneses de entre 20 y 60 años participaron en el estudio. Los participantes no tenían evidencia subjetiva u objetiva de inflamación de los senos paranasales según su historial o endoscopia nasal. Se excluyeron las mujeres embarazadas. El protocolo del estudio fue aprobado por las juntas de revisión ética de Kao Corporation y Edogawa Hospital (número de aprobación: T141-180620) y se llevó a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki. Todos los participantes dieron su consentimiento informado.

Se midieron los umbrales olfativos para tres compuestos (PEA, Amb y tBM). Las fuentes de compra de los odorantes se muestran en la Tabla complementaria 2. Los umbrales sensoriales se recopilaron utilizando odorantes diluidos con aceite mineral inodoro (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) utilizando un procedimiento de elección forzada de tres alternativas. Las concentraciones más altas de soluciones odorantes fueron las siguientes: PEA a 1000 ppm; Amb a 10.000 ppm; y tBM a 1 ppm. Se diluyeron al doble 15 veces para preparar 16 diluciones de cada odorante. En cada prueba, a los participantes se les presentaron tres juegos de botellas en orden aleatorio: un juego contenía el estímulo odorante y los otros solo contenían el diluyente (vacíos). Después de oler cada conjunto secuencialmente, se pidió a los participantes que identificaran la botella que contenía el olor. No se requirió reconocimiento ni identificación de calidad. Por cada detección incorrecta, se presentó la siguiente concentración más baja. El primer ensayo comenzó con la concentración más baja y, durante dos detecciones correctas consecutivas, se presentó una concentración cuatro veces mayor en el segundo ensayo. Para dos detecciones correctas consecutivas en la segunda prueba, se administró la siguiente concentración más alta hasta que se identificó correctamente el odorante. Cuando no se identificó la primera concentración de odorante en el segundo ensayo, se presentó la siguiente concentración más baja. Las concentraciones promedio de las detecciones correctas primera y final se identificaron como la puntuación umbral. Las concentraciones se presentaron como los tiempos de dilución de las soluciones (15–0). La detección de la concentración más baja se calificó como 15 y la detección errónea de la concentración más alta se calificó como 0. Hubo un error en el protocolo durante las pruebas de umbral para dos participantes, y se excluyeron sus puntajes de umbral.

La saliva entera se recogió directamente en un tubo de plástico después de enjuagar la boca con agua. La muestra se centrifugó (10.000 rpm durante 10 min) y se congeló a -80 ℃ hasta que se necesite. La saliva entera se recolectó el mismo día que la prueba de umbral de olor, y el moco olfativo se recolectó de 1 a 3 semanas después en el Hospital Edogawa. Las muestras de moco se recolectaron utilizando almohadillas neuroquirúrgicas (BEMSHEETS XR, 0,7 × 0,7 cm; KAWAMOTO Corporation, Osaka, Japón). La almohadilla podía absorber un máximo de aproximadamente 150 mg de agua, y la cantidad de todo el moco recogido estaba por debajo de los 150 mg. Luego, las almohadillas se colocaron en un tubo con un orificio en el fondo hecho con una aguja de calibre 20. Se colocó otro tubo debajo del tubo perforado y se centrifugó (10.000 rpm durante 10 min). Las secreciones nasales recogidas se congelaron a -80 ℃ hasta su uso. En un sujeto, no se recogió mucosidad INM de las cavidades nasales izquierda o derecha. En un sujeto, la almohadilla colocada en el INM izquierdo cayó hasta la boca durante la recolección. Para todos los análisis se utilizó únicamente la mucosidad del INM recogida de la cavidad nasal derecha. El moco olfativo se recogió durante 5 días (6 participantes/día). Durante este tiempo, el clima en un día fue soleado y en los otros días fue lluvioso.

Las concentraciones de proteína se determinaron usando el ensayo de proteína BCA con BSA como estándar. Las concentraciones de CES-1 se determinaron utilizando un kit ELISA CES-1 (RayBiotech; Peachtree Corners, GA, EE. UU.). Las concentraciones de glutatión se determinaron utilizando un kit de cuantificación GSSG/GSH (DOJINDO, Kumamoto, Japón). Se mezclaron y analizaron cantidades iguales de moco recogido de los lados izquierdo y derecho, excepto una muestra de moco INM, como se describió anteriormente.

N-metil-2-pirrolidona (NMP; Kishida Chemical Co., Ltd., Osaka, Japón; para la industria electrónica) y ácido nítrico 1,38 (60 %; Kanto Chemical Co., Inc., Tokio, Japón; para la industria electrónica) industria) se usaron para preparar la solución de la curva de calibración y la dilución de la muestra. SPEX CertiPrep (XSTC-13 solución estándar mixta elemental, 10 μg/mL, 5 % HNO3; SPEX, Metuchen, NJ, EE. UU.) se utilizó como solución estándar para la curva de calibración. Una mezcla de 5 μL de moco OC y moco INM (mezcla izquierda y derecha) o 100 μL de sobrenadante de saliva se disolvió en 5 mL de NMP que contenía ácido nítrico al 1%. Las mediciones automáticas se realizaron utilizando un espectrómetro de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) iCAP Qs de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.) conectado al muestreador de medición automática ESI SC2 DX y controlado por el software Qtegra. Una muestra diluida con NMP que contiene ácido nítrico al 1% se introdujo directamente en una cámara de ciclón de cuarzo ajustada a 4 ℃ por autoaspiración. Se introdujo oxígeno en el plasma para evitar la acumulación de carbono. Se aplicaron condiciones de colisión de gas helio para la medición de Zn. Se aplicaron condiciones de reacción de colisión de plasma frío y gas NH3-He al 1% a todos los elementos excepto Zn (Tabla complementaria 3).

La curva de calibración se preparó con una solución de NMP añadida con ácido nítrico al 1 % en concentraciones de 0, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 5, 10, 50 y 100 ng/ml. Se obtuvo linealidad (r > 0,999) para todos los elementos, y se confirmó que el límite inferior de cuantificación de la muestra inyectada era de 0,1 ng/g (100 ppb para el moco OC e INM, 5 ppb para la saliva). Las muestras estaban demasiado concentradas para determinar las concentraciones de Na, K y Ca; por lo tanto, se prepararon curvas estándar en el rango de 0,1 ppb a 100 ppb para Mg y de 0,1 a 10 ppb para los demás. Se prepararon muestras en blanco empapando almohadillas neuroquirúrgicas en agua Milli-Q y luego recolectando el agua como moco olfativo. Las concentraciones de Mg, Fe, Cu y Zn en las muestras de moco o saliva fueron más altas que las de las muestras en blanco. La concentración de Fe de una muestra de moco de OC fue mayor que la de los demás (~ 40 ppm, mientras que el promedio de los demás fue de 1,67 ppm). Esta muestra podría haber contenido una pequeña cantidad de sangre; por lo tanto, los datos de ICP-MS de esta muestra se excluyeron de los análisis.

El ADN que codifica pigOBP se sintetizó utilizando los servicios de síntesis de genes GenScript (GenScript Biotech Corp., Piscataway, NJ, EE. UU.). El gen sintetizado es básicamente la misma secuencia que NM_213796.1; sin embargo, codifica proteínas que portan la mutación F88W46 y la etiqueta His6 en el extremo C-terminal pero sin la secuencia de 15 aminoácidos que codifica una secuencia de péptido señal en el extremo N-terminal. El gen sintetizado se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI y se clonó en pET-22b (Merck Biosciences, Madison, WI, EE. UU.). Esto dio como resultado el vector de expresión final que codifica pigOBP con una secuencia líder pelB N-terminal. pigOBP se expresó y purificó mediante GenScript utilizando la cepa BL21 (DE3) de Escherichia coli y una columna de Ni. La concentración se determinó utilizando el ensayo de proteínas de Bradford con BSA como estándar. pigOBP se detectó usando mAb anti-His de ratón (GenScript) en análisis de transferencia Western.

Las mediciones se realizaron como se describió previamente46. Las soluciones odorantes (Amb, l-mentona y citronelol) se prepararon como soluciones madre 100 mM en EtOH. Se preparó 1-AMA (Accu Standard Inc., New Haven, CT, EE. UU.) como una solución madre 1 mM en EtOH. pigOBP se preparó como una solución madre 60 μM en solución salina tamponada con fosfato. Las soluciones madre se congelaron y luego se diluyeron con Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) para los ensayos. Agregamos 50 µL de la solución probada a una placa negra de 96 pocillos (Corning Inc., Corning, NY, EE. UU.). La emisión de fluorescencia de las soluciones se registró en un lector de placas multimodo EnSight (PerkinElmer, Waltham, MA, EE. UU.).

La solución de la mezcla de olores (40 μL) que contenía Amb, l-mentona y citronelol se preparó en Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) con o sin varias concentraciones de pigOBP. Luego, la solución se pipeteó en un vial con espacio de cabeza de 2 ml (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.), se selló con un tapón de rosca con septum de politetrafluoroetileno (PTFE)/silicona y se calentó durante 5 minutos a 37 °C en agua. baño para exponer la fibra SPME (polidimetilsiloxano [PDMS]/divinilbenceno [DVB], df 65 μm, SUPELCO, Inc., Bellefonte, PA, EE. UU.) al espacio de cabeza del vial durante 30 min. Los dispositivos SPME se acondicionaron antes del muestreo. Se utilizó un cromatógrafo de gases Agilent 7890A conectado a un detector selectivo de masas Agilent 5975C (Agilent Technologies). La columna analítica utilizada para GC/MS fue una columna DB-WAX para aminas (60 m × 0,25 mm id, GL Sciences, Tokio, Japón). Se utilizó helio (99,99995%) como gas portador en un modo de presión constante (56,07 kPa). La temperatura del inyector (desorción) fue de 250 °C. La fibra SPME se desorbió en el modo sin saliva y el tiempo de desorción fue de 1 min. El programa de temperatura del horno osciló entre 40 °C (4 min) y 240 °C a 6 °C/min. La ionización de electrones se utilizó en la EM con un rango de exploración de 35 a 300 m/z. La temperatura de la fuente de iones se mantuvo a 230 °C.

Se añadió una solución de mezcla de olores (0,2 μL) que contenía Amb, Muscone y PEA disueltos en etanol a 20 μL de solución salina, solución de BSA, moco olfativo, moco OC desnaturalizado y saliva en un vial con espacio de cabeza de 2 ml (Agilent Technologies). Esto se selló instantáneamente con un tapón de rosca con tabique de PTFE/silicona. Los olores del espacio de cabeza se analizaron usando SPME GC/MS como se describió anteriormente. La columna analítica de GC/MS era una columna VF-WAXms (30 m × 0,25 mm de d.i., Agilent Technologies). El área del pico del cromatograma de iones extraídos (EIC) de los odorantes (m/z = 252 para Amb, 238 para Muscone y 91 para PEA) se ajustó de acuerdo con el área del pico EIC del etanol (m/z = 45) entre las muestras. Después de la extracción con SPME, la solución acuosa se diluyó con agua (80 μL) y se añadió acetato de etilo (100 μL). La solución se agitó para extraer los olores residuales en la capa orgánica. La capa orgánica se analizó usando GC/MS. La muestra inyectada fue de 1 μL en el modo dividido (10:1).

Los inhibidores de CES-1 (BNPP y bencilo) y CES-1 recombinante se adquirieron de TCI (Tokio, Japón) y R&D Systems (Minneapolis, MN, EE. UU.), respectivamente. Para las reacciones enzimáticas, se agregaron mezclas de olores (0,2 μL, 10 mM en etanol) a 20 μL de solución salina, saliva, moco INM, moco OC, muestras diluidas (con solución salina) y soluciones CES-1 (50 mM Tris-HCl, pH 7,5) con o sin inhibidores de CES-1 (solución acuosa para BNPP y solución de dimetilsulfóxido [DMSO] para bencilo, 100 μM a la concentración final). La solución se incubó a 37 ℃ durante 1 h, luego se diluyó con 80 μL de agua. Se añadió acetato de etilo (100 μL) a la solución: la solución bifásica se agitó con vórtex para extraer olores y metabolitos. La capa orgánica se recogió y analizó utilizando GC/MS como se describió anteriormente. Las concentraciones se determinaron utilizando el área del pico EIC. En el análisis de las relaciones estructura-actividad con varios acetatos, el área del pico del éster 19 casi no cambió a lo largo de los experimentos y no se detectó el alcohol correspondiente. Por lo tanto, el área del pico entre los experimentos se ajustó usando el área del pico.

Para determinar el curso temporal de la reacción enzimática de pCA, se agregaron 1,6 μL de pCA (10 mM en etanol) a 160 μL de moco OC diluido × 10, solución de CES-1 (0,57 μg/mL) y vehículos. Luego, se recolectaron 20 μL de la solución de reacción a los 0, 1, 5, 10, 20, 40, 60 y 120 min después de la adición de pCA, se incubaron a 37 ℃ y se sometieron a GC/MS. Para determinar el valor de Michaelis-Menten, se agregó pCA a la solución diluida de moco OC o CES-1, en concentraciones finales de 50, 100, 250, 500 y 1000 μM. Las soluciones de reacción se incubaron a 37 ℃ durante 5 min (moco OC diluido) o 40 min (solución CES-1), y las velocidades de reacción se determinaron mediante análisis GC/MS. Los valores de Michaelis-Menten Vmax y Km se calcularon utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). pCA (concentración final = 100 μM) se utilizó para determinar la reactividad enzimática de muestras de moco OC individuales (tiempo de incubación = 5 min).

pCA se preparó como una solución de aceite mineral al 0,1%. La concentración de p-cresol fue de 0,001% en agua destilada. Las soluciones odorantes (1 ml) se colocaron en viales de vidrio de 110 ml. Muscone se aplicó directamente a bolas de algodón esterilizadas (1,0 mg) en un vial. Los viales se dejaron abiertos para equilibrar el espacio de cabeza. No se determinó el número de participantes con el genotipo OR9Q2, ya que no se informaron variantes sin sentido. Se pidió a ocho participantes que olieran p-cresol y la intensidad percibida del olor se registró en una escala de 95 mm, marcada desde ningún olor hasta un olor fuerte. Luego se les dio una muestra (agua, p-cresol, muscone o pCA) y se les pidió que inhalaran durante 2 min. p-Cresol se presentó nuevamente en un vial diferente y se pidió a los participantes que calificaran nuevamente la intensidad percibida del olor. El cambio de intensidad se calculó como sigue: antes de la desensibilización, los valores se normalizaron al 100% y luego se compararon con los valores después de la desensibilización. La clasificación fue un valor positivo (mayor intensidad de p-cresol después de la desensibilización) o un valor negativo (disminución de la intensidad de p-cresol después de la desensibilización) hasta un mínimo de -100 (sin olor percibido después de la desensibilización). En cada prueba, se presentaron como Muestra A dos ensayos separados con el mismo odorante. Las clasificaciones de p-cresol de los participantes presentadas en momentos separados se compararon para determinar la confiabilidad. Si la diferencia entre las clasificaciones era > 30 %, la evaluación se consideraba poco fiable y las clasificaciones de intensidad se asignaban arbitrariamente. Los resultados fueron luego excluidos del análisis. A los participantes se les dio un descanso de 10 minutos entre cada prueba para revertir los efectos de la desensibilización.

El ensayo de luciferasa Dual-Glo™ (Promega, Madison, WI, EE. UU.) se realizó como se describió anteriormente55. Brevemente, OR marcado con FLAG-Rho, elemento de respuesta cAMP (CRE)/luc2PpGL4.29, pRL-CMV y RTP1S se agregaron al medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con polietilenimina Max (PEI-MAX, Polysciences, Warrington, PA, EE. UU.) para cada pocillo de una placa de 96 pocillos recubierta con poli-d-lisina (Corning) o de una placa de 384 pocillos recubierta con poli-d-lisina (Corning). Después de 15 min de incubación, se añadió la suspensión celular a la solución de transfección. Después de 24 h de transfección, se retiró el medio y las células transfectadas se estimularon con una solución odorante diluida en DMEM. Se midieron las actividades del gen informador. La actividad inducida por olores se calculó como la relación CRE:luc (intensidad de luminiscencia de la luciferasa de luciérnaga dividida por la de la luciferasa de Renilla) o aumento de veces (Luc(N) dividida por Luc(0)). Luc(N) era la relación CRE:luc de un pozo estimulado con odorante específico, y Luc(0) era la relación CRE:luc de un pozo específico no estimulado. El análisis de datos se realizó con el software Microsoft Excel o GraphPad Prism.

El experimento se llevó a cabo como se describió previamente65. Las células se sembraron en placas con fondo de vidrio de 35 mm (Iwaki Inc., Chiba, Japón) recubiertas con poli-d-lisina. Luego, las células se transfectaron con Rho-OR9Q2, Gα15 y RTP1S con PEI-MAX. Después de 24 h de incubación, las células cargadas con Fura-2/AM se lavaron con solución de Ringer (NaCl 140 mM, KCl 3 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, glucosa 10 mM y HEPES 10 mM [pH 7,4]) y sometido a imágenes de calcio. Se aplicaron secuencialmente a las células una serie de odorantes en solución de Ringer utilizando una bomba peristáltica a un caudal de 2,0 ml/min. Los niveles de Ca2+ intracelular se detectaron como fluorescencia Fura-2/AM a 510 nm mediante excitación a 340 o 380 nm utilizando AQUA COSMOS (Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japón).

El sistema de ensayo GloSensor™ cAMP (Promega, Madison, WI, EE. UU.) evaluó el efecto del volumen medio en las respuestas de OR en tiempo real a la fase de vapor de los odorantes (Amb o p-cresol). Las células HEK293T se transfectaron con 30 ng/pocillo de plásmido RTP1S, 67,5 ng/pocillo de plásmido OR9Q2 o 30 ng/pocillo de plásmido cOR5A2 y 67,5 ng/pocillo de plásmido 20F (Promega) en una placa negra de 96 pocillos (Corning, Glendale, AZ , EE.UU). A las 24–40 h posteriores a la transfección, se reemplazó el DMEM (Thermo Fisher Scientific) con 50 μL de medio independiente de CO2 (Thermo Fisher Scientific) que contenía reactivo GloSensor cAMP al 4 % (Promega). Después de 2 h de equilibrio a 37 ℃, el volumen del medio se ajustó de 0 a 50 μL en incrementos de 10 μL. Inmediatamente después, se colocó una bola de algodón de 7 mm (Osaki Medical, Nagoya, Japón) sobre el medio en cada pocillo. La placa se cargó en un sistema funcional de detección de drogas (FDSS)/µCELL (HAMAMATSU Photonics, Shizuoka, Japón). Después de 20 min de equilibrio a 37 ℃, se aplicaron automáticamente 150 μL de solución acuosa de olor a cada bola de algodón a 50 μL/s. La luminiscencia celular se midió a intervalos de 5 s durante 60 min. En cada punto de tiempo, se restó un valor de luminiscencia sin procesar de las células estimuladas con olor por un valor de las células no estimuladas. La relación entre el valor sustraído individual y el valor máximo en la condición de 50 μL se definió como la respuesta normalizada (%).

Los ensayos de entrada de calcio se realizaron usando un FDSS/µCELL. Se obtuvieron las células en las que se expresó TRPM8 de manera estable, como se describió previamente66. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas con poli d-lisina (Corning) a razón de 20.000 células/pocillo y se cultivaron durante la noche. A continuación, las células se incubaron con solución de Ringer, complementada con Fluo4-AM 2 µM, probenecid 0,5 mM y Pluronic F-127 al 0,01 %, a 37 °C durante 1 hora. Las células se lavaron una vez y se recuperaron con el tampón de ensayo. Posteriormente, las placas se insertaron en el FDSS y las células y las muestras de prueba se preincubaron durante 5 min. El tampón de ensayo se precalentó a 37 °C y el ensayo se realizó a 30 °C en el FDSS. Las respuestas máximas de [Ca2+]i se midieron como la relación de intensidad de fluorescencia máxima (intensidad de fluorescencia máxima/intensidad de fluorescencia basal) y se expresaron como porcentajes de la respuesta a ionomicina 4 µM.

Todos los datos discutidos en el documento están disponibles en el manuscrito o en el Apéndice SI.

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Descargar referencias

Agradecemos a Madelyn Abraham por establecer un método para evaluar la adaptación del olor en los participantes, a Mari Kobayashi por generar los plásmidos de OR y a los miembros del Hospital Edogawa por la recolección de moco.

Junkichi Yokoyama

Dirección actual: Departamento de Otorrinolaringología-Cirugía de Cabeza y Cuello, Hospital Nadogaya, 2-1-1 Shinkashiwa, Kashiwa, Chiba, Japón

Investigación científica sensorial, Kao Corporation, 2606 Akabane, Ichikai-machi, Haga, Tochigi, Japón

Tomohiro Shirai, Dan Takase, Chisaki Uehara, Naoko Saito, Aya Kato-Namba y Keiichi Yoshikawa

Investigación en ciencia analítica, Kao Corporation, 1334 Minato, Wakayama, Wakayama, Japón

kuniyuki nakanishi

Departamento de Otorrinolaringología-Cirugía de Cabeza y Cuello, Hospital Edogawa, 24-2-18 Higashikoiwa, Edogawa, Tokio, Japón

Junkichi Yokoyama

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TS, conceptualización, metodología, validación, análisis formal, investigación, curación de datos, redacción—preparación del borrador original, redacción—revisión y edición, y administración del proyecto; DT, metodología, investigación y redacción—preparación del borrador original; JY, investigación y supervisión; KN, investigación; CU, investigación; SN, investigación y supervisión; AK-N., investigación; KY, conceptualización, metodología, validación, análisis formal, investigación, redacción—preparación del borrador original, redacción—revisión y edición, visualización.

Correspondencia a Keiichi Yoshikawa.

Los autores, excepto JY, son empleados de Kao Corporation. Kao Corporation tiene una patente (P6588715) relacionada con los receptores de olores humanos para p-cresol y ha solicitado patentes relacionadas con métodos para la administración de agua a la mucosidad nasal y para la estimulación con vapor de los quirófanos. No hay productos actualmente en desarrollo o comercializados para declarar. Este trabajo fue apoyado por Kao Corporation, que pagó los salarios de los autores. El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

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Reimpresiones y permisos

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Recibido: 10 noviembre 2022

Aceptado: 10 de enero de 2023

Publicado: 18 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27937-1

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