Interrupción y recuperación del microbioma nasal después del tratamiento con mupirocina en portadores y no portadores de Staphylococcus aureus

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 19738 (2022) Citar este artículo

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Los procedimientos de descolonización nasal contra el patógeno oportunista Staphylococcus aureus se basan en el uso de fármacos antimicrobianos tópicos, cuyo impacto en la microbiota nasal es poco conocido. Examinamos este impacto en portadores y no portadores sanos de S. aureus. Este es un estudio prospectivo de cohortes de intervención de 8 portadores de S. aureus y 8 no portadores tratados con baños nasales de mupirocina y clorhexidina. Se tomaron hisopos nasales secuenciales durante 6 meses. S. aureus se detectó mediante cultivo cuantitativo y se genotipificó mediante tipificación spa. Se utilizó un código de barras de nivel de especie 16S basado en ARN para evaluar la diversidad microbiana viva. Las especies Dolosigranulum pigrum, Moraxella nonliquefaciens y Corynebacterium propinquum se correlacionaron negativamente con la portación de S. aureus. El tratamiento con mupirocina eliminó eficazmente S. aureus, D. pigrum y M. nonliquefaciens, pero no las corinebacterias. La recolonización de S. aureus en los portadores ocurrió más rápidamente que la recolonización de las especies dominantes en los no portadores (mediana de 3 frente a 6 meses, respectivamente). La mayoría de los aislamientos de S. aureus recolonizadores tenían el mismo tipo de spa que el aislamiento inicial. El impacto del tratamiento con mupirocina-clorhexidina en la microbiota nasal aún era detectable después de 6 meses. La recolonización de S. aureus precedió a la recuperación de la microbiota, lo que enfatiza la fuerte adaptación de este patógeno al nicho nasal y la eficacia transitoria del procedimiento de descolonización.

Staphylococcus aureus es un patógeno oportunista y una causa frecuente de infecciones graves. Aproximadamente el 20% de la población general son portadores persistentes de S. aureus y otro 30% son portadores intermitentes1. S. aureus se transporta comúnmente en la nariz y con menos frecuencia en la garganta, la piel y el perineo1.

Los portadores de Staphylococcus aureus tienen un mayor riesgo de infección después de procedimientos invasivos y cirugía2,3. Para prevenir infecciones, varios países recomiendan eliminar S. aureus de la nariz antes de la intervención en riesgo mediante un procedimiento de descolonización4. Por lo general, esto implica un tratamiento antimicrobiano tópico con ungüento nasal de mupirocina con o sin gel de baño cutáneo para el cuerpo y el cabello con clorhexidina. Han surgido diferentes enfoques de descolonización debido a los costos y problemas de organización en el cuidado de la salud5. Mientras que algunos aconsejan tratar a todos los pacientes que se someten a intervenciones de riesgo, otros limitan la descolonización solo a los portadores confirmados.

Si bien sabemos que la composición del microbioma nasal está relacionada con la presencia de S. aureus6,7, el impacto de los procedimientos de descolonización en la microbiota nasal aún no se comprende por completo. En estudios previos del microbioma nasal, la presencia de S. aureus se asoció con abundancias relativas más altas de Cutibacterium acnes, Corynebacterium accolens y estafilococos no aureus, y con abundancias más bajas de Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Dolosigranulum spp. y Cutibacterium granulosum6,7. Estas asociaciones sugieren que la distribución de especies microbianas en la nariz influye en la persistencia de S. aureus, posiblemente a través de la competencia por los nutrientes y los sitios de unión epiteliales8. A su vez, la alteración de la distribución microbiana después de un procedimiento de descolonización podría afectar la probabilidad de recolonización persistente de S. aureus y, desde un punto de vista clínico, el fracaso de la descolonización. Sin embargo, la magnitud y la duración de las alteraciones de la microbiota después de la descolonización no están aclaradas. Hasta ahora, un estudio de microbioma de un solo paciente encontró cambios en la composición y la biodiversidad de la microbiota nasal después del tratamiento con mupirocina9, lo que contrasta con un estudio de culturómica anterior de 5 voluntarios sanos en el que no se encontraron cambios significativos en la riqueza y diversidad de la microbiota hasta 1 mes después de la descolonización10.

Para descifrar las relaciones entre la portación nasal de S. aureus, la microbiota nasal y los procedimientos de descolonización, llevamos a cabo un estudio prospectivo de cohortes de intervención de portadores y no portadores de S. aureus, monitoreando los cambios en la comunidad microbiana durante 6 meses después del tratamiento con mupirocina-clorhexidina. Usando cultivos cuantitativos y metabarcodificación 16S, examinamos el impacto de la descolonización en las comunidades bacterianas y el retraso en la recolonización con S. aureus y otras especies dominantes.

De 35 voluntarios, se incluyeron 8 portadores y 8 no portadores (ver diagrama de flujo de selección de pacientes en la Fig. 1). El grupo de portadores de S. aureus estaba formado por 3 hombres y 5 mujeres de 22 a 71 años (mediana, 26 años). Los no portadores fueron 2 hombres y 6 mujeres de 18 a 62 años (mediana, 56 años). Ningún participante informó el uso de antivirales, antiparasitarios, inmunosupresores o probióticos en los 3 meses previos o durante el estudio. Un no transportista informó el uso de amoxicilina/ácido clavulánico, 5 días antes del muestreo D0 y nuevamente entre el muestreo M3 y M6. Este participante se retuvo porque el uso de antimicrobianos ocurrió después del reclutamiento y la composición de la microbiota no difería de la de otros no portadores antes de la descolonización. Ningún participante informó haber sido portador de MRSA anteriormente. Los 16 participantes tenían al menos 1 factor de riesgo para la adquisición de S. aureus (Tabla complementaria 1).

Diagrama de flujo de reclutamiento de participantes. En total, 35 voluntarios fueron reclutados y evaluados para determinar su elegibilidad. Dieciséis participantes completaron el estudio, de los cuales 8 eran portadores y 8 no eran portadores.

La dinámica de eliminación y recolonización de S. aureus después del tratamiento de descolonización se examinó mediante cultivo cuantitativo (Fig. 2A) y metabarcodificación de ARN (Fig. 2B). Ambos métodos mostraron una fuerte disminución en las cargas de S. aureus inmediatamente después de la descolonización seguida de un aumento gradual que indica recolonización para algunos portadores. La descolonización fallida en un portador se confirmó en la primera muestra posterior a la descolonización por ambos métodos (Fig. 2). La recolonización se definió como un cultivo positivo para S. aureus (> 8 UFC/mL) posterior a la descolonización. Cinco portadores (C1, C2, C5, C6 y C7) se recolonizaron durante el período de seguimiento, incluidos 3 portadores dentro del mes posterior a la descolonización. En el grupo de no portadores se encontraron 4 cultivos positivos para S. aureus post-descolonización, 3 de los cuales con solo 1 UFC/mL.

Dinámica de la abundancia de S. aureus en muestras nasales de portadores y no portadores en proceso de descolonización. Se muestra la abundancia de S. aureus en cultivo cuantitativo (UFC/ml en una escala logarítmica; A) y la proporción en metabarcodificación de ARN 16S (B) a lo largo del tiempo en 8 portadores (rojo) y 8 no portadores (azul). D0 y D7 denotan muestras tomadas inmediatamente antes y después del procedimiento de descolonización, respectivamente. Las líneas discontinuas indican los datos de cada participante. Las líneas sólidas y la banda de color indican la media y el intervalo de confianza del 95 %. Tanto el análisis de cultivo como el de código de barras identificaron una fuerte disminución de la abundancia de S. aureus después de la descolonización seguida de recolonización. En promedio, la abundancia de S. aureus posterior a la descolonización fue menor que antes de la descolonización.

La metabarcodificación de ARN mostró diferentes resultados de recolonización. Mientras que también se recolonizaron 5 portadores (C1, C2, C3, C5 y C8) de acuerdo con el metabarcode de ARN, se encontraron discrepancias para 4 portadores (C3, C6, C7 y C8). Para 2 portadores (C5 y C8), la metabarcodificación de ARN mostró recolonización sin cultivo positivo. Otros 2 portadores (C6 y C7) no mostraron recolonización en metabarcode de ARN a pesar de un cultivo positivo.

Los tipos de spa se determinaron en portadores que mostraban recolonización de S. aureus en cultivo (n = 5). Todos menos uno de los portadores de S. aureus recolonizados mostraron el mismo tipo de spa en las muestras anteriores y posteriores a la descolonización. En 2 portadores, se encontró un tipo de spa diferente, lo que sugiere una colonización transitoria por una cepa diferente de la cepa portadora anterior a la descolonización. Los resultados de la tipificación Spa se muestran en la Tabla 1. Los detalles del retraso en la recolonización y las cargas de CFU/mL se muestran en la Fig. 1 complementaria. No se encontró resistencia fenotípica a la meticilina en los aislamientos analizados.

En general, la descolonización de S. aureus siguió siendo exitosa durante un período de 6 meses en solo 3 participantes (38 %) (Fig. 2 y Fig. 1 complementaria), en consonancia con los hallazgos anteriores11. Curiosamente, el enfoque de metabarcodificación detectó pequeñas proporciones (~ 1–5 %) de lecturas de S. aureus 2 días y 1 mes después de la descolonización en varios no portadores (Fig. 2B). Esto podría reflejar una invasión transitoria del nicho nasal por aislados de S. aureus, posiblemente facilitada por la interrupción del microbioma nasal inducida por la descolonización, como se describe en la microbiota intestinal después de las perturbaciones inducidas por antibióticos12. Este transporte intermitente es de esperar en la población normal.

Antes de la descolonización, se identificaron nueve especies bacterianas dominantes en la microbiota nasal, incluidas S. aureus, S. epidermidis, D. pigrum, Moraxella nonliquefaciens, C. acnes y 4 especies de Corynebactaria (Fig. 3A,C; consulte los detalles de cada participante en el Suplemento). Figura 2). D. pigrum, un taxón común que se encuentra en las fosas nasales anteriores, fue particularmente abundante y prevalente en los no portadores. C. propinquum estuvo presente en ambos grupos y fue en promedio un 15% más abundante en los no portadores. Las especies sensibles a la mupirocina, incluidas S. aureus y S. epidermidis, D. pigrum y M. nonliquefaciens, prácticamente se eliminaron de la microbiota después de la descolonización, mientras que las corinebacterias resistentes a la mupirocina y C. acnes permanecieron sustancialmente abundantes13,14. Después de la descolonización, la proporción promedio de C. pseudodiphteriticum en los no portadores, pero no en los portadores, se multiplicó por diez después de 7 días y la proporción de S. epidermidis se multiplicó por diez después de 1 mes. En otros momentos, las proporciones promedio de C. pseudodiphteriticum y S. epidermidis fueron comparables en portadores y no portadores. En los 2 portadores y 4 no portadores colonizados con más del 10 % de D. pigrum (Fig. 2 complementaria), 1 fue recolonizado con D. pigrum después de 1 mes, 2 después de 3 meses y todos después de 6 meses. M. nonliquefaciens, que se observó en 2 no portadores, recolonizó solo a 1 participante después de 6 meses. La mediana del tiempo de recolonización con D.pigrum y M.nonliquefaciens, 2 taxones principales presentes en los no portadores, fue de 6 meses. Por el contrario, la mediana del tiempo de recolonización de S. aureus en los portadores fue de 3 meses. Los perfiles de microbiota de los participantes individuales se muestran en la Fig. 2 complementaria.

Evolución de la estructura comunitaria de la microbiota nasal antes y después de la descolonización de mupirocina en portadores y no portadores de S. aureus. Se muestran gráficos de barras de diversidad de proporciones promedio de especies (A,C) y la diferencia de estas proporciones (B,D) en cada paciente (líneas discontinuas) y en promedio (líneas continuas; el área sombreada es la banda de confianza del 95% de la media ). Un valor alto para la disimilitud de Bray-Curtis indica una gran diferencia en la estructura de la comunidad en relación con el estado inicial de la microbiota antes de la descolonización. Se tomaron muestras nasales inmediatamente antes de la descolonización (D0) y después de 7 días (D7) y 1 (M1), 3 (M3) y 6 (M6) meses en 8 S. aureus portadores (A,B) y no portadores (C, D). Los nombres completos de las bacterias son, en orden: Staphylococcus aureus, Dolosigranulum pigrum, Moraxella nonliquefaciens, Corynebacterium propinquum, Corynebacterium accolens, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Corynebacterium macginleyi, Staphylococcus epidermidis, Cutibacterium acnes.

Para proporcionar una evaluación más sintética de los cambios inducidos por la descolonización de la estructura de la comunidad microbiana, calculamos la disimilitud de Bray-Curtis del ensamblaje de especies en cada punto de tiempo, en relación con el punto de tiempo D0 inicial en el mismo paciente (Fig. 3B, D ). La disimilitud promedio de Bray-Curtis fue máxima inmediatamente después de la descolonización tanto en los portadores como en los no portadores, lo que denota el estado más perturbado de la microbiota. Sorprendentemente, la disimilitud disminuyó considerablemente en los portadores, pero se mantuvo mayormente estable en los no portadores, lo que indica que la microbiota de los portadores (parcialmente) volvió a su estado inicial más rápido que en los no portadores, en línea con una recolonización más rápida por S. aureus en comparación con las especies dominantes encontradas en no portadores Después de 6 meses, las diferencias promedio con respecto al estado inicial permanecieron sustanciales (~ 0.5–0.7) tanto en portadores como en no portadores (Fig. 3B, D). Es importante destacar que la evolución de la estructura de la población varió mucho entre los participantes (ver líneas discontinuas en la Fig. 3B, D), con patrones de recuperación de la microbiota que van desde una recuperación rápida (desigualdad < 0,2 después de 1 mes) hasta prácticamente ninguna recuperación (desigualdad > 0,9 después de 6 meses). ) tanto en portadores como en no portadores.

En este estudio longitudinal de portadores y no portadores de S. aureus sometidos a descolonización nasal con mupirocina, encontramos que la recolonización de S. aureus en los portadores ocurrió más rápidamente que la recolonización de las especies dominantes en los no portadores. Estos hallazgos resaltan la eficacia transitoria del procedimiento de descolonización de S. aureus y la fuerte adaptación de S. aureus al nicho nasal.

Junto a un caso de descolonización fallida, observamos una recolonización frecuente con S. aureus durante el período de seguimiento de 6 meses. El tiempo de recolonización varió de 1 a 3 meses, en línea con observaciones previas en las que el retraso de la recolonización varió de 2 semanas a 6 meses después del tratamiento con mupirocina15. En otro estudio longitudinal que recolectó muestras de 571 participantes cada 2 meses durante > 2 años, los antibióticos antiestafilocócicos aumentaron la tasa de adquisición de S. aureus dentro de los 4 meses posteriores al tratamiento16, lo que sugiere que la interrupción de la microbiota por los antibióticos facilita la invasión de S. aureus. En nuestro estudio, 4 de 5 casos de recolonización finalmente ocurrieron con el mismo tipo de spa aislado del portador inicialmente. Sin embargo, también se demostró una colonización transitoria con otro tipo de spa. Esto está de acuerdo con otros estudios que muestran portación longitudinal de la misma cepa, con portación intermitente de otras cepas también16,17,18. Si bien los estudios longitudinales sugieren que la pérdida y adquisición de S. aureus ocurren como eventos naturales16,18, otra razón para la recolonización podría ser la falta de una descolonización exitosa. La resistencia al tratamiento de descolonización podría facilitar la recolonización. Sin embargo, dado que la vigilancia nacional holandesa de la resistencia en S. aureus ha mostrado niveles bajos de resistencia a la mupirocina (1 %)19, parece poco probable que esto impulse la recolonización en los participantes de nuestro estudio. La recolonización de un sitio del cuerpo extranasal no tratado, como la faringe, oa través de miembros del hogar es una explicación más probable.

Junto a la pérdida de S. aureus, la descolonización provocó la eliminación inmediata de S. epidermidis, D. pigrum y M. nonliquefaciens de la nariz. En los no portadores, se observó una tendencia hacia una mayor abundancia de C. propinquum, mientras que en los portadores efectivamente descolonizados se mostró un aumento de C. accolens y S. epidermidis. De hecho, el tratamiento con mupirocina se ha relacionado previamente con un aumento de la abundancia relativa de corinebacterias (no clasificadas) y C. acnes, junto con una disminución de la abundancia de S. epidermidis20. Juntos, estos resultados implican un reordenamiento de la microbiota nasal después del tratamiento de descolonización y la eliminación de especies sensibles a la mupirocina, incluido S. aureus, lo que permite que nuevos taxones invadan el nicho nasal.

Nuestro estudio tiene limitaciones más allá de su pequeño tamaño de muestra. Para mejorar la participación en el estudio, adoptamos una estrategia de automuestreo que permitió a los participantes enviar muestras a través del servicio de correo regular. Este método se ha encontrado apropiado para la detección de S. aureus previamente21,22. Sin embargo, el retraso en el transporte provocó que el 20% de las muestras se procesaran > 48 h después del muestreo. Dado que solo 3 de 27 muestras demoradas en portadores fueron cultivos negativos, el riesgo de falsos negativos en los cultivos de S. aureus debido al transporte puede considerarse bajo. Sin embargo, se desconoce el impacto de la demora en los enfoques de metacodificación de barras. Sin embargo, el retraso en el transporte no tuvo efecto en los resultados generales de recolonización en este estudio.

Se encontraron discrepancias entre los resultados de cultivos cuantitativos y la codificación de metabarras de ARN con respecto a la presencia de S. aureus en las muestras posteriores a la descolonización. Definimos la recolonización en función de un cultivo positivo para S. aureus (> 8 UFC/mL) después de la descolonización, de acuerdo con nuestra definición de portador de S. aureus. La carga bacteriana nasal variable, la composición intrínseca de la microbiota, así como la influencia potencial del transporte a la instalación de secuenciación sumado a los análisis de código de barras de ARN de varios pasos se encuentran entre los muchos factores que explican tales diferencias con los resultados del cultivo. Ambos métodos coincidieron en el estado de recolonización solo en tres portaaviones.

En general, nuestros hallazgos resaltan la sensibilidad de la comunidad bacteriana nasal al tratamiento con mupirocina y enfatizan el hecho de que el objetivo de descolonización, a saber, S. aureus, vuelve a ingresar al nicho nasal comparativamente más rápido que las especies dominantes en los no portadores. Esto respalda el uso actual de la mupirocina como un procedimiento de prevención a corto plazo que precede a una intervención de riesgo identificada, en lugar de un medio para eliminar los aislamientos de S. aureus circulantes.

Este es un estudio prospectivo de cohortes de intervención de portadores y no portadores sanos de S. aureus en los Países Bajos. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Ley holandesa de investigación médica con seres humanos (OMM). El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica local del Centro Médico de la Universidad Erasmus de Róterdam, Países Bajos (MEC-2018-091). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. Los participantes fueron reclutados a través de anuncios en universidades holandesas y las redes sociales de los equipos de investigación. Los criterios de exclusión fueron edad < 18 años, uso de antibióticos, antiparasitarios, antifúngicos o probióticos 3 meses antes del reclutamiento, alergia conocida a los componentes del tratamiento de intervención, mujeres embarazadas y lactantes, enfermedades crónicas conocidas que afectan el sistema inmunológico, enfermedades crónicas graves de la piel, estado inmunocomprometido o uso de medicamentos inmunosupresores.

Después de completar un cuestionario de elegibilidad, todos los voluntarios fueron evaluados para ser portadores de S. aureus como se describió anteriormente23. El estado de portador de S. aureus se determinó mediante un cultivo cuantitativo de 2 hisopos nasales semanales. Los portadores persistentes de S. aureus se definieron como 2 cultivos positivos con > 8 UFC/mL para cada cultivo. Los no portadores se definieron como 2 cultivos negativos para S. aureus. Los portadores intermitentes de S. aureus fueron excluidos de una mayor participación en el estudio. Los voluntarios elegibles se inscribieron por orden de llegada.

Se pidió a los participantes elegibles que completaran un cuestionario sobre los factores de riesgo para la adquisición de S. aureus. Todos los participantes recibieron tratamiento de descolonización. La descolonización consistió en pomada nasal de mupirocina (2 %, GlaxoSmithKline BV, Zeist, Países Bajos) dos veces al día y solución cutánea de gluconato de clorhexidina (4 % p/v, Regent Medical Overseas Limited, Oldham, Reino Unido) una vez al día, ambas durante 5 días.

Se tomaron muestras nasales 1 día antes de la descolonización (D0) y 2 días (D7), 1 mes (M1), 3 meses (M3) y 6 meses (M6) después de la descolonización. Todos los participantes recibieron una demostración personal de muestreo nasal por parte del investigador ejecutivo. A partir de entonces, los participantes tomaron todas las muestras insertando un hisopo (ESwab, 490CE.A, Copan Italia, Brescia, Italia) en una fosa nasal y rotando 5 veces, repitiendo esto en la segunda fosa nasal usando el mismo hisopo. Los hisopos se recolectaron en un recipiente lleno de 1 ml de Liquid Amies modificado, una solución de recolección y transporte, y se enviaron a través del servicio de correo regular (sin control de temperatura) o se depositaron personalmente en el laboratorio.

Se realizaron cultivos cuantitativos de S. aureus para examinar la dinámica del transporte de S. aureus durante el período de seguimiento de 6 meses después de la descolonización. Los contenedores de hisopos se agitaron en vórtice durante 20 s antes de colocarlos en placas. Se sembraron diluciones seriadas de medio de Amies en agar con sal de fenol manitol (PHMA) y se incubaron durante 2 días a 37 °C. Los hisopos se colocaron en caldo de sal de fenol manitol (PHMB) y se incubaron durante 7 días a 37 °C para el enriquecimiento. El crecimiento de S. aureus se confirmó mediante una prueba de aglutinación de látex (Staph Plus Latex Kit, Diamondial, Viena, Austria). Se seleccionaron colonias de S. aureus morfológicamente diferentes para tipificación spa y detección de resistencia a la meticilina utilizando agar BBL CHROMagar MRSA II (BD, Breda, Países Bajos).

Se realizó la tipificación molecular de aislados de S. aureus para inferir si la recolonización con S. aureus en portadores descolonizados involucraba el mismo tipo spa. La tipificación se limitó al último momento de cultivo positivo de S. aureus y al último momento de cultivo positivo de S. aureus después de la descolonización en portadores recolonizados. Los lisados de ADN de S. aureus se prepararon hirviéndolos en Tris-HCl 10 mM, EDTA disódico 1 mM, pH 8,0 o extrayéndolos con el kit QIAamp DNA Mini (QIAGEN, Venlo, Países Bajos) según las instrucciones del fabricante. La amplificación de la región repetida de la proteína A (spa) de S. aureus se realizó mediante PCR con 2 conjuntos de cebadores. Un conjunto consistió en el cebador directo spa-1113, 5′-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3 'y el cebador inverso spa-1514, 5'-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3'24. El otro conjunto consistió en los cebadores directos spa-F1, 5′-AACAACGTAACGGCTTCATCC-3′ y spa-F2 5′-AGACGATCCTTCAGTGAGC-3′ y el cebador inverso spa-R1 5′-GCTTTTGCAATGTCATTTACTG-3′. Los amplicones se purificaron con ExoSAP-IT (Applied Biosystems) según las instrucciones del fabricante y se enviaron para análisis de secuencia (Baseclear, Leiden, Países Bajos). Las secuencias resultantes se analizaron utilizando BioNumerics v7.6 (Applied Maths NV, Sint-Martens-Latem, Bélgica) y los tipos de spa se asignaron mediante el uso de la base de datos RidomStaphType (Ridom GmbH, Würzburg, Alemania).

El impacto de la descolonización en el microbioma nasal y la recuperación de la estructura del microbioma después de la descolonización se examinaron mediante la codificación de metabarras 16S rRNA. El medio Amies de cada contenedor de hisopos nasales se almacenó a -80 °C el día de la recepción en el laboratorio del estudio en Rotterdam, NL, y luego se envió a -80 °C al laboratorio de análisis de microbiomas en Lyon, FR. Para capturar correctamente el impacto de la descolonización en la microbiota viva, la metabarcodificación utilizó ARN ribosómico 16S basado en ARN (ARNr, que se conserva en las células vivas pero se elimina rápidamente después de la muerte celular o la lisis) en lugar de la secuencia de codificación del ADN, ya que el ADN puede persistir durante períodos de tiempo prolongados después de la muerte celular25,26,27,28. El ARN se extrajo usando el protocolo de tejido Mag Bind® Total RNA 96 Kit (Omega Bio-tek) de 150 µL de material de muestras. La lisis celular se realizó utilizando perlas (Disruptor plate C plus—Omega Bio-tek) y proteinasa K durante 15 min a 2600 rpm, seguido de 10 min a temperatura ambiente sin agitación, y finalizó con una digestión con ADNasa I de 20 min a temperatura ambiente . El ARN se cuantificó utilizando el kit de ARN QuantiFluor en Tecan Safire (TECAN). Se usaron 10 ng de ARN total para la transcripción inversa usando el kit de síntesis de ADNc FIREScript RT (Solis Biodyne) con cebadores aleatorios, luego se purificó el ADNc con el reactivo SPRIselect (Coulter de Beckman) y se cuantificó.

La región rRNA V1-V3 se amplificó por PCR utilizando 5x HOT BIOAmp® BlendMaster Mix 12,5 mM MgCl 2 (Biofidal), 10x GC rich Enhancer (Biofidal) y BSA 20 mg/mL. La reacción de PCR consistió en 30 ciclos a 56 °C utilizando el cebador directo 27F, 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ y el cebador inverso 534R, 5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGATTACCGCGGCTGCTGG-3′ en 25 µL de solución. Los productos de PCR se purificaron con perlas SPRIselect (Beckman Coulter) en 20 µl de agua sin nucleasas y se cuantificaron con QuantiFluor dsDNA (Promega). Las muestras se indexaron con los códigos de barras de lllumina con los mismos reactivos de PCR durante una PCR de 12 ciclos, luego se purificaron y cuantificaron como se mencionó anteriormente. Las muestras se normalizaron y agruparon, luego se secuenciaron con Illumina MiSeq V3 Flow Cell siguiendo las recomendaciones del fabricante para una aplicación de extremo emparejado de 2 × 300 pb. Se obtuvo una media de 130k lecturas corregidas por muestra.

Los tampones experimentales se utilizaron como controles negativos para detectar la contaminación por ARN bacteriano fuera de la muestra. La extracción de ARN se controló mediante una mezcla interna de Staphylococcus aureus ATCC29213 y Escherichia coli ATCC25922 vivos en proporciones iguales, lo que permitió evaluar el sesgo de extracción en bacterias grampositivas y negativas. El sesgo de amplificación por PCR se controló utilizando una mezcla de ADN comercial de 8 especies bacterianas (ZymoBIOMICS™ Microbial Community DNA Standard).

La calidad de las lecturas de secuenciación se controló y recortó. Los pares de lectura emparejados se fusionaron utilizando BBMap versión 38.49 (disponible en https://sourceforge.net/projects/bbmap/), con opciones predeterminadas además de un tamaño único mínimo de 150 pb con un puntaje de calidad Phred promedio superior a 10, y un tamaño total de par de mínimo 400 pb. Los adaptadores de PCR se quitaron con cutadapt v.2.1 (Martin 2011) y luego se desreplicaron con vsearch v.2.12.029 con la opción de dimensionamiento. Para la asignación de especies, las lecturas se alinearon con las secuencias de la base de datos NCBI blast 16S_ribosomal_RNA (fecha de versión 03.12.2020) usando Blastn v.2.11.0+30,31, manteniendo un máximo de 20 objetivos de referencia. Los recuentos de lectura por especie bacteriana se normalizaron para tener en cuenta las variaciones específicas del taxón del número de copias de los genes 16S rRNA utilizando la base de datos NCBI rrnDB-5.5 basada en el número medio de copias de genes en el taxón.

Para optimizar la resolución de la asignación taxonómica de lectura de secuenciación, utilizamos un software bioinformático interno disponible públicamente en https://github.com/rasigadelab/taxonresolve. Brevemente, cuando una lectura coincide con secuencias de varias especies con puntajes de alineación idénticos, las canalizaciones de asignación taxonómica generalmente generan el nivel taxonómico más alto, como el género (p. ej., Staphylococcus spp. cuando una lectura coincide con S. aureus y S. epidermidis). Esta pérdida de información puede ser problemática cuando la discriminación a nivel de especie es importante. Para evitar la pérdida de información a nivel de especie, el software taxonresolve asigna lecturas con especies inciertas a grupos de especies en lugar de a géneros.

Se eliminaron las especies bacterianas consideradas presentes de fuentes contaminantes como los reactivos de los kits y encontradas en los controles negativos, en su mayoría del género Bacillus. Se retuvieron un total de 1376 especies o grupos de especies. Las curvas de rarefacción correspondientes al esfuerzo de secuenciación para evaluar la riqueza de especies dentro de las muestras se muestran en la Fig. 3 complementaria. La mayoría de las muestras alcanzaron una meseta después de 40,000 secuencias.

Dado el pequeño tamaño de la muestra en comparación con el número de variables y especies consideradas en este estudio, no se realizó una prueba de hipótesis y proporcionamos una evaluación descriptiva de los resultados. En cifras, los intervalos de confianza del 95 % de las medias se calcularon con base en la aproximación normal, después de la transformación logarítmica para CFU/mL y la transformación logarítmica de probabilidades para cantidades restringidas al intervalo [0, 1], como proporciones.

En los análisis de diversidad microbiana, conservamos las 9 especies bacterianas más prevalentes y agrupamos las otras especies en una categoría "Otros". Para evaluar la interrupción y la posible recuperación de la microbiota, se evaluó la divergencia de la microbiota muestreada en relación con la microbiota inicial previa al tratamiento (D0) utilizando la disimilitud de Bray-Curtis en cada punto de tiempo de muestreo en relación con la primera muestra del mismo paciente. .

El código de software de los análisis está disponible en https://github.com/rasigadelab/macotra-metabarcoding. Los datos están disponibles en https://zenodo.org/record/6382657. Los análisis y las cifras utilizaron el software R v3.6.032 con los paquetes dplyr33, ggplot234, vegan35 y MicrobiomAnalyst disponibles en https://www.microbiomeanalyst.ca36,37.

Los conjuntos de datos generados para este estudio están disponibles abiertamente en Zenodo en https://doi.org/10.5281/zenodo.6382657.

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Agradecemos a todos los participantes por su contribución a este estudio. Agradecimientos especiales a Willem van Wamel, Patricia Vellekoop y Willemien Zandijk por su asistencia en el laboratorio, así como a Agnès Nguyen (Biofidal, Vaulx-en-Velin, Francia), por sus interesantes debates y su asistencia con respecto a la estrategia de metacodificación de barras utilizada en este documento. Este trabajo fue parte del proyecto MACOTRA, financiado por ZonMw Grant número 547001006 y ANR Grant número 16-JPEC-0006. Reconocemos a todos los miembros del grupo de estudio MACOTRA que se enumeran en la información complementaria.

Estos autores contribuyeron por igual: Valérie O. Baede, Anaïs Barray, Margreet C. Vos y Jean-Philippe Rasigade.

Departamento de Microbiología Médica y Enfermedades Infecciosas, Centro Médico de la Universidad Erasmus MC de Róterdam, Róterdam, Países Bajos

Valerie O. Baede, Mehri Tavakol y Margreet C. Vos

CIRI, Centro Internacional de Investigación en Infectología, Universidad de Lyon, Inserm U1111, Ecole Normale Supérieure de Lyon, Universidad Lyon 1, CNRS, UMR5308, Lyon, Francia

Anaïs Barray, Gérard Lina y Jean-Philippe Rasigade

Centro Nacional de Referencia para Estafilococos, Instituto de Agentes Infecciosos, Hospital Croix Rousse, Hospices Civils de Lyon, Lyon, Francia

Anaïs Barray, Gérard Lina y Jean-Philippe Rasigade

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AB y VB escribieron el manuscrito original. MV y JPR revisaron y editaron el manuscrito. MV, GL, JPR conceptualizaron y supervisaron el proyecto. VB y MT realizaron la contratación de la cohorte. AB, VB y MT diseñaron metodologías in vitro y generaron datos y cifras. AB desarrolló programas de análisis de bioinformática y bioestadística para el estudio. AB, VB, MT y JPR realizaron análisis estadísticos. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Jean-Philippe Rasigade.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Baede, VO, Barray, A., Tavakol, M. et al. Interrupción y recuperación del microbioma nasal después del tratamiento con mupirocina en portadores y no portadores de Staphylococcus aureus. Informe científico 12, 19738 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21453-4

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Recibido: 07 mayo 2022

Aceptado: 27 de septiembre de 2022

Publicado: 17 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21453-4

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