Reconstitución de la biosíntesis de alcaloides de indol monoterpénicos en Nicotiana benthamiana modificada por ingeniería genómica

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 949 (2022) Citar este artículo

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Los alcaloides de indol monoterpénicos (MIA) son una clase diversa de productos naturales de plantas que incluyen una serie de compuestos importantes desde el punto de vista médico. Nos propusimos reconstituir la vía de la estrictosidina, un intermediario clave de todos los MIA, del metabolismo central en Nicotiana benthamiana. Una desventaja de este huésped es que su rico metabolismo de fondo da como resultado la derivatización de algunas moléculas producidas heterólogamente. Aquí usamos el análisis transcriptómico para identificar glicosiltransferasas que están reguladas al alza en respuesta a intermediarios biosintéticos y producen líneas de plantas con mutaciones específicas en los genes que las codifican. La expresión de la ruta MIA temprana en estas líneas produce un perfil de producto más favorable. La biosíntesis de estrictosidina se reconstituyó con éxito, con los mejores rendimientos obtenidos por la coexpresión de 14 enzimas, de las cuales una importante enzima similar a la proteína de látex (MLPL) de Nepeta (menta gatera) es fundamental para mejorar el flujo a través de la vía iridoide. La eliminación de las glicosiltransferasas endógenas no afecta los rendimientos de la estrictosidina, lo que destaca que el flujo metabólico de las enzimas de la ruta hacia un intermediario biosintético estable minimiza la necesidad de manipular el metabolismo endógeno del huésped. La producción de estrictosidina in planta amplía la gama de productos MIA susceptibles de síntesis biológica.

La aplicación de enfoques de biología sintética a los sistemas de plantas de ingeniería ha facilitado los avances en el control y la expresión de las rutas biosintéticas, lo que permite que las plantas sirvan como un chasis de producción bioquímica alternativa1,2. Un pariente del tabaco, N. benthamiana3,4 se ha convertido en una especie favorecida para la producción a base de plantas de proteínas farmacéuticas5 y la reconstitución de la vía metabólica2. Los éxitos incluyen la producción a escala de gramos de triterpenoides6 y la producción a escala de miligramos de etopósidos7. Sin embargo, varios estudios informaron la acumulación de productos secundarios no deseados, presumiblemente producidos por las actividades fuera del objetivo de las enzimas endógenas de N. benthamiana, como las oxidasas y las glicosiltransferasas8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18. Aunque la actividad de las enzimas endógenas se ha explotado en algunos estudios para producir nuevas moléculas9 o para compensar la falta de una enzima conocida19, la derivatización de moléculas en su mayor parte es una desventaja, ya que reduce la pureza potencial y el rendimiento del compuesto objetivo.

Los alcaloides de indol monoterpénicos (MIA) son un gran grupo de productos naturales producidos en plantas de los cuales se han identificado más de 300020. Esta clase de moléculas incluye muchos compuestos medicinalmente valiosos que se usan para tratar la adicción, las afecciones cardíacas, la demencia, el dolor, el cáncer, la malaria y la diabetes. La planta productora de MIA mejor caracterizada es Catharanthus roseus (bígaro de Madagascar), que produce más de 130 MIA, incluidas las bioactivas vinblastina y vincristina, que se utilizan como quimioterapia. Sin embargo, estas valiosas moléculas están presentes en bajas concentraciones en C. roseus (0,0005 % del peso seco)21, lo que limita su disponibilidad. El cultivo masivo de células de C. roseus es factible, pero aún no se ha informado sobre una línea celular que produzca estas moléculas anticancerígenas de manera consistente22. Aunque se han informado métodos para la expresión transitoria23 y la transformación genética estable24 de plantas de C. roseus, la ingeniería genética de la planta nativa huésped para aumentar los rendimientos de estos compuestos sigue siendo técnicamente difícil. Además, la complejidad estructural de muchos MIA significa que la síntesis química suele ser un desafío25,26. En consecuencia, son deseables rutas alternativas para la producción y el reciente descubrimiento de pasos faltantes en la ruta de la vinblastina27,28 hace que la reconstrucción de la ruta en un huésped heterólogo sea una opción cada vez más atractiva.

Lograr la producción de cantidades terapéuticamente útiles de MIA requiere ingeniería de vías para maximizar el flujo metabólico a través de las primeras partes de la vía. La estrictosidina es el último intermediario biosintético común del que derivan los más de 3000 MIA conocidos. La reconstitución de su ruta biosintética de ~11 pasos en microorganismos puede requerir un ajuste extenso de las condiciones de expresión de la enzima y la optimización de la cepa29, por ejemplo, la expresión deficiente de geraniol 8-hidroxilasa (G8H) ha obstaculizado la producción de estrictasidina en la levadura30. Es probable que la obtención de rendimientos útiles de moléculas como la vinblastina, que requeriría la expresión de más de 16 enzimas más allá de la estrictosidina, requiera una ingeniería sustancial, aunque recientemente se ha modificado la levadura para producir ajmalicina a través de la integración genómica de 29 casetes de expresión, lo que demuestra la potencial para la reconstrucción heteróloga del esfuerzo de vías biosintéticas de productos naturales de plantas31.

Si bien la levadura sigue siendo un hospedante prometedor para la expresión heteróloga de vías metabólicas, las proteínas derivadas de plantas con frecuencia requieren menos optimización e ingeniería para una expresión exitosa en una planta hospedante. Miettinen y colaboradores utilizaron la expresión en N. benthamiana para reconstituir la vía iridoide de C. roseus, lo que permitió dilucidar los cuatro pasos faltantes restantes de la vía26. Sin embargo, se encontraron con un cuello de botella metabólico a mitad de la vía de 13 pasos que requería la reconstitución en dos fases y la última parte requería la provisión de un sustrato intermedio (iridotrial) para obtener estrictosidina27. Además, el rico metabolismo endógeno de N. benthamiana actuó sobre los intermediarios hidrofóbicos tempranos de la biosíntesis de estrictosidina para producir una variedad de productos derivatizados sin salida.

Aquí diseñamos con éxito la producción de novo de estrictosidina en N. benthamiana. Identificamos glicosiltransferasas endógenas que derivatizan intermediarios de vías tempranas y demostramos que se acumulan menos derivados en líneas de plantas con mutaciones de pérdida de función en los genes que codifican estas enzimas. Utilizamos genes adicionales que mejoran la producción de nepetalactol y permiten que se produzcan altos niveles de estrictosidina a partir del metabolismo central de N. benthamiana sin necesidad de suplementos de precursores o intermediarios de metabolitos. En general, este estudio demuestra el potencial de N. benthamiana como chasis de bioproducción para moléculas pequeñas.

La estrictosidina se deriva del terpenoide secologanina. La secologanina pertenece a la clase iridoide de monoterpenos, que se derivan de la oxidación, la ciclación reductora y la derivatización sustancial del geraniol. Después de la formación, la secologanina se condensa y cicla con triptamina para formar estrictosidina. Estudios previos que apuntan a la expresión heteróloga de vías de biosíntesis de terpenoides de bajo peso molecular en N. benthamiana han reportado la acumulación de intermediarios biosintéticos derivatizados29. Para investigar la derivatización en los primeros pasos de la vía iridoide, expresamos transitoriamente las primeras enzimas de la vía de la estrictosidina mediante la coinfiltración de N. benthamiana con cepas de A. tumefaciens que contienen plásmidos que codifican los pasos de la vía hasta el cis-trans nepetalactol (Fig. 1). Para mejorar el grupo de sustrato de pirofosfato de geraniol (GPP) de la vía plastidial 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfato/1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato (MEP/DOXP), incluimos un geranilo bifuncional/ geranilgeranil pirofosfato sintasa de Picea abies (PaGPPS) y 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato sintasa (DXS) de C. roseus (CrDXS), ambos dirigidos al plástido. Para producir geraniol, estos se coexpresaron con geraniol sintasa de C. roseus (CrGES), que anteriormente se demostró que permite la producción heteróloga de geraniol en plantas32. Luego añadimos los tres primeros pasos de la ruta de la estrictosidina dedicada: geraniol 8-oxidasa (CrG8H), 8-hidroxigeraniol oxidorreductasa (CrGOR) e iridoide sintasa (CrISY) para producir cis-trans nepetalactol y realizamos espectrometría de masas de alta resolución de N. hojas de benthamiana para identificar los productos enzimáticos. Según lo informado por Dong y colaboradores32, encontramos que la expresión transitoria de CrDXS, PaGPPS y CrGES produce una variedad de derivados de geraniol glicosilados y oxidados no volátiles (Fig. 1 y Tabla complementaria 1). La adición de pasos posteriores de la ruta, hasta el nepetalactol cis-trans, modificó aún más el perfil de los productos derivados. En general, se acumularon menos derivados a medida que se añadían más pasos de la ruta, lo que sugiere que la fuerte expresión constitutiva permitió que las enzimas de la ruta superaran a los sustratos endógenos (Fig. 1).

Una modificación común fue la adición de azúcares de pentosa y hexosa, por ejemplo, Pico 1, hexosil hidroxigeraniol [M + HCOOH-H], 3,84 min, m/z 377,1817; Pico 2, hexosil hidroxicitronelal [M + HCOOH-H], 4,12 min, m/z 379,1974; pico 3, ácido trihexosilgeránico [M + HCOOH-H], 4,35 min, m/z 699,2703); Pico 4, pentosil hexosil geraniol [M + HCOOH-H], 5,32 min, m/z 493,2288; Pico 5, acetil dihexosil geraniol [MH], 5,454 min, m/z 519,2445; DXS, 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato sintasa; GPPS, geranil difosfato sintasa; GES, geraniol sintasa; G8H, geraniol 8-oxidasa; GOR, 8-hidroxigeraniol oxidorreductasa; ISY, iridoide sintasa.

Una de las características comunes de la derivatización fue la adición de azúcares de pentosa y hexosa. Las enzimas que son principalmente responsables de la glicosilación de productos naturales de plantas, incluidos los monoterpenos, pertenecen a la familia de glicosiltransferasa 133. Presumimos que muchas de estas UGT probablemente estén involucradas en la biosíntesis de metabolitos secundarios endógenos utilizados, por ejemplo, en defensa. Alternativamente, estos UGT pueden estar involucrados en la desintoxicación de una variedad de metabolitos. Por lo tanto, consideramos que es poco probable que la introducción de mutaciones de pérdida de función en los genes que las codifican tenga un impacto sustancial en el desarrollo de las plantas cultivadas en los entornos controlados utilizados para la agroinfiltración. Sin embargo, aunque se pueden identificar fácilmente grandes cantidades de UGT mediante la búsqueda de homólogos apropiados en los genomas de todas las plantas vasculares, la predicción de las especificidades del sustrato y la identificación de genes individuales responsables de modificar metabolitos específicos es un desafío34.

Para investigar si los cambios en la expresión génica se correlacionaban con las modificaciones químicas observadas, realizamos un análisis transcriptómico de muestras de hojas infiltradas con la vía iridoide. Como se ha observado previamente una respuesta transcripcional sustancial a la agroinfiltración35, comparamos los cambios en la expresión tanto con los controles no infiltrados como con las plantas de control infiltradas con una proteína fluorescente verde (GFP) expresada constitutivamente (ver métodos). Observamos que la expresión de algunas UGT aumentó en respuesta a la infiltración, mientras que otras aumentaron específicamente en respuesta a la expresión de la vía al geraniol o al nepetalactol (Tabla complementaria 2). También realizamos un análisis filogenético de todas las UGT de la Familia 1 identificadas en el transcriptoma de la hoja de N. benthamiana (ver métodos), investigando su relación con las encontradas en Arabidopsis thaliana y con las UGT de plantas previamente caracterizadas que se sabe que son activas en sustratos de geraniol y nepetalactol (Fig. .2 y la Fig. 1 complementaria).

Los grupos AP se anotan según la nomenclatura utilizada por Caputi et al. 201233. Los taxones marcados indican enzimas en las que se introdujeron posteriormente mutaciones dirigidas mediadas por Cas9. Los círculos grises rellenos en los nodos indican soportes de arranque >95. La barra de escala representa el número de sustituciones por sitio. En la figura complementaria 1 se proporciona un árbol con todos los taxones y valores de arranque.

Presumimos que una forma de mejorar el chasis de N. benthamiana sería eliminar estos UGT endógenos introduciendo mutaciones en los genes que los codifican. Utilizando tanto los perfiles de expresión como la selectividad de sustrato predicha, seleccionamos objetivos genéticos para la mutagénesis dirigida mediada por Cas9. Luego construimos 8 plásmidos dirigidos a un total de 25 UGT (Tabla 1). Primero diseñamos tres vectores binarios para la transformación estable de plantas de N. benthamiana de tipo salvaje (pEPQDPKN0720, pEPQDPKN0724, pEPQDPKN0361) (Figuras complementarias 2–4). Estas construcciones codificaron sgRNA dirigidos a genes que codifican UGT en los grupos D, E y G, que previamente se demostró que son activos en geraniol36,37, así como UGT no caracterizados de los mismos grupos con la lógica de que pueden estar activos en el mismo sustrato (Tabla 1 y Tabla complementaria 3). Como las UGT a las que se dirigía cada construcción estaban estrechamente relacionadas, algunos sgRNA podían dirigirse a más de un gen. En consecuencia, cada construcción codificó seis sgRNA dirigidos al primer o segundo exón de cuatro UGT del Grupo D, cinco UGT del Grupo E o tres UGT del Grupo G (Tabla 1 y Figs. 2-4 complementarias). Estas construcciones se administraron a plantas de tipo salvaje y se determinaron los genotipos de plantas transgénicas (T0) regeneradas. Descartamos las líneas en las que el genotipo no estaba claro o indicaba un posible quimerismo genético y seleccionamos líneas con mutaciones homocigóticas, heterocigóticas o bialélicas en las ubicaciones objetivo. Los genotipos se confirmaron en plantas T1, junto con la presencia o ausencia del T-DNA. Los 18 sgRNAs introdujeron mutaciones en al menos una planta T0. En particular, no pudimos recuperar ninguna planta con mutaciones de cambio de marco tanto en NbUGT72B58 como en NbUGT72B35; sin embargo, pudimos recuperar líneas con mutaciones en cada uno de estos genes en combinación con otras UGT del Grupo E (Tabla 1). Seleccionamos seis plantas T1 con mutaciones en diferentes combinaciones de 12 genes individuales (Tabla 1). Todas las líneas eran morfológicamente normales sin cambios evidentes en el crecimiento y desarrollo y madurando al mismo tiempo que las líneas de control.

También diseñamos y construimos cinco vectores virales basados ​​en TMV que codifican sgRNA móviles usando los métodos descritos previamente por Ellison y colegas38. Cuatro vectores contenían sgRNA móviles dirigidos a UGT que estaban fuertemente regulados al alza después de la infiltración (pEPQDKN0777), fuertemente regulados al alza en respuesta a la expresión de la vía del geraniol (pEPQDKN0778) o la vía del nepetalactol (pEPQDKN0779) o tenían recuentos altos normalizados después de la expresión de la vía del nepetalactol ( pEPQDKN0780) (Tabla 1, Figura complementaria 5 y Tabla complementaria 2). Un vector final codificó tres sgRNA móviles dirigidos a cuatro UGT que se sabe que están activos en geraniol37 (pEPQDKN0781) (Tabla 1, Figura complementaria 5 y Tabla complementaria 3). Estos vectores se infiltraron en plantas transgénicas que expresaban constitutivamente Cas9. Las semillas de la progenie (designadas como E1) se recolectaron de vainas que se formaron en tallos en los que se detectaron mutaciones en los sitios objetivo (ver métodos). Se analizaron los genotipos de las plantas E1, seleccionando nuevamente líneas con mutaciones homocigóticas, heterocigóticas o bialélicas en las ubicaciones objetivo. En general, el método de sgRNA móvil fue menos eficiente, ya que ocho de quince sgRNA móviles introdujeron mutaciones en su objetivo. Esto resultó en la selección de cinco líneas E1, cada una con mutaciones en uno, dos o tres UGT objetivo (Tabla 1 y Fig. 5 complementaria). Como anteriormente, no hubo cambios en el crecimiento o el desarrollo.

Para investigar si la introducción de mutaciones en las UGT reduciría la presencia de derivados de geraniol, se infiltraron plantas mutadas cuyos genotipos de todos los loci diana habían sido confirmados con cepas de agrobacterium que codifican enzimas de la ruta para producir geraniol o cis-trans nepetalactol. Las muestras se analizaron en busca de derivados mediante UHPLC/MS como se discutió previamente y el perfil metabólico se comparó con las líneas parentales (líneas silvestres y transgénicas Cas9) y con la progenie de una línea de control no transgénica, no mutada, regenerada en cultivo de tejidos y cultivada. en idénticas condiciones.

Las plantas con mutaciones en el grupo A UGT, NbUGT94E7, no acumularon ácido trihexosil geránico (m/z 699.2713, [M + HCOOH-H]) luego de la expresión de las enzimas de la ruta para producir geraniol o nepetalactol (Fig. 3, Datos complementarios 1 , Figuras complementarias 6 y 7). La presencia de acetil dihexosil geraniol (m/z 519,2445, [MH]) también se eliminó en muestras en las que se expresaron enzimas de la vía para producir nepetalactol. Además, tres líneas con mutaciones en el Grupo G NbUGT85 A73 en combinación con NbUGT72AY1 (Grupo E) o NbUGT85A74 y NbUGT85A104 (Grupo G) acumularon menos o nada de hexosil hidroxigeraniol (m/z 377.1817, [M + HCOOH-H]) , hexosil hidroxicitronelal (m/z 379.1974, [M + HCOOH-H]), pentosil hexosil geraniol (m/z 493.2288, [M + HCOOH-H]) o acetil dihexosil geraniol (m/z 519.2445, [MH]) ( Fig. 3, Datos complementarios 1, Figuras complementarias 6 y 7). Curiosamente, estos picos solo estaban ausentes en las muestras en las que se expresaron las enzimas de la ruta para producir nepetalactol.

Las identidades asignadas de los picos 1-5 se proporcionan en la Fig. 1. Los asteriscos indican que la actividad sobre el geraniol se ha informado previamente. Los valores y las barras de error representan la media y el error estándar de n = 3 réplicas biológicas. Para la comparación por pares de todas las líneas mutadas con las tres líneas de control (barras grises), las medias seguidas de una letra griega común (α, β, γ, δ) no son significativamente diferentes mediante un ANOVA unidireccional con post-hoc Tukey HSD al 5% de nivel de significación. Las parcelas sin valores de letras griegas no tienen líneas experimentales con diferencias significativas de las tres líneas de control.

Luego nos enfocamos en extender la vía iridoide con el objetivo de reconstituir la vía hasta el intermedio de estrictosidina central. Un intento previamente informado encontró un cuello de botella metabólico que requirió la infiltración de iridotrial para obtener estrictosidina38. La ruta biosintética para la producción de nepetalactona cis-trans en el género Nepeta comparte la ruta secoiridoide de C. roseus hasta la reducción estereoselectiva de 8-oxogeranial a un enol intermedio por la iridoide sintasa dependiente de NADPH (ISY)39. Recientemente se ha demostrado que en Nepeta ISY funciona en combinación con deshidrogenasa-reductasas de cadena corta relacionadas con nepetalactol (NEPS) o una enzima similar a la proteína de látex principal (MLPL) para controlar la estereoselectividad del cierre del anillo40,41. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la adición de MLPL de Nepeta mussinii (también conocida como Nepeta racemosa), que es específica de la estereoquímica que se encuentra en la estrictosidina, mejoraría el flujo a través de la vía en N. benthamiana. Esfuerzos recientes en la reconstitución en sistemas de levadura31 y sin células42 también han indicado que esta enzima mejora sustancialmente el rendimiento.

La infiltración de todas las enzimas de la ruta para producir 7-DLA sin MLPL no produjo un pico para 7-DLA (m/z esperado 359,1349) o 7-DLA acilado (m/z esperado 401,1447), de acuerdo con informes anteriores39 (Fig. 4) . Sin embargo, la inclusión de MLPL produjo un pico claro de m/z 359,1342 que coincide con el tiempo de retención del estándar 7-DLA. La exclusión de la glucosil transferasa del ácido 7-desoxiloganético (7-DLGT) produce un pico con la misma m/z pero no coincide con el tiempo de retención de 7-DLA. Es posible que las UGT endógenas puedan usar ácido 7-desoxiloganético para producir un éster de glucosa. Como se observó con la vía temprana, la expresión fuerte y constitutiva de los genes de la vía (en este caso, 7-DLGT) puede superar a las enzimas nativas, lo que da como resultado la ausencia de este pico de éster de glucosa putativo en los espectros de la vía 7-DLA completa.

La expresión transitoria de todas las enzimas de la ruta más MLPL produce un pico de 359,1342 m/z que coincide con la masa y el tiempo de retención de un estándar de ácido 7-desoxilogánico (7-DLA). La ruta reconstituida sin DLGT también produce un pico de 359,1343 m/z pero en un tiempo de retención diferente, probablemente debido a las glicosiltransferasas endógenas de N. benthamiana que producen el éster de glucosa del ácido 7-desoxiloganético. DXS, 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato sintasa; GPPS, geranil difosfato sintasa; GES, geraniol sintasa; G8H, geraniol 8-oxidasa; GOR, 8-hidroxigeraniol oxidorreductasa; ISY, iridoide sintasa; MLPL, similar a la proteína principal del látex; IO, iridoide oxidasa; 7-DLGT, ácido 7-desoxiloganético glucosiltransferasa.

Sobre la base de las condiciones experimentales que produjeron con éxito 7-DLA, agregamos secuencialmente las cinco enzimas de la vía restantes y medimos los intermedios de la vía después de la adición secuencial de cada gen (Fig. 5a, Datos complementarios 1, Figs. complementarias 8–12). La coinfiltración de cepas que expresan enzimas para toda la ruta produce un pico distinto a 531 m/z que coincide con el estándar de estrictosidina (Fig. 5b, c, Datos complementarios 1, Figura complementaria 11). Esta configuración de vías produce 4,29 ± 2,00 µM de estrictosidina que se correlaciona con 0,23 ± 0,11 mg de estrictosidina/g de peso seco de tejido foliar (0,023% DW). El único intermediario biosintético principal que se observó que se acumulaba era la loganina, lo que sugiere que la secologanina sintasa es un paso de cuello de botella. Esto contrasta con datos previos que sugieren que el ácido logánico O-metiltransferasa (LAMT), que tiene una baja afinidad por el sustrato (Km = 12,5–14,8 mM)43,44, podría ser un paso limitante de la velocidad de las últimas etapas de la vía secoiridoide. Además de la estrictosidina, la expresión transitoria de la ruta completa también produce una cantidad más pequeña de un compuesto (Fig. 5c, Fig. 11 complementaria) con un cambio de masa de 86 Da de la estrictosidina, lo que sugiere que esto puede ser un derivado malonilado de la estrictosidina producido por aciltransferasas endógenas de N. benthamiana. La expresión transitoria de la vía de la estrictosidina sin GPPS y MLPL (Fig. 5b, Datos complementarios 1) confirma el efecto beneficioso de estas enzimas sobre el rendimiento de la estrictosidina. La adición de MLPL aumentó la producción de estrictosidina > 60 veces mientras que la suplementación con GPPS mejoró el rendimiento ~ 5 veces. La suplementación con DXS no cambió la cantidad de estrictosidina producida (Fig. 1).

a Cuantificación de productos intermedios y estrictosidina mediante análisis UPLC/MS. b La ausencia de MLPL reduce la producción de estrictosidina >60 veces mientras que la suplementación con GPPS mejora el rendimiento ~5 veces. c el cromatograma de iones totales del tejido foliar infiltrado con la vía completa a la estrictosidina (incluidos DXS, GPPS y MLPL). El pico a los 4,09 min de tiempo de retención en el cromatograma de iones totales (TIC) y el cromatograma de iones extraídos (EIC) a 531,2336 m/z coincide con un estándar de estrictosidina. ND, no detectado; 7-DLH, ácido 7-desoxilogánico hidroxilasa; LAMT, ácido logánico O-metiltransferasa; SLS, secologanina sintasa; TDC, triptófano descarboxilasa; STR, estrictosidina sintasa. Los valores y las barras de error representan la media y el error estándar de n = 3 o n = 6 réplicas biológicas (muestras de hojas independientes).

También infiltramos la ruta completa en las líneas previamente identificadas con mutaciones en UGT94E7 (Grupo A) o NbUGT85A73 (Grupo G), cada una de las cuales había mostrado la acumulación de menos derivados iridoides tempranos. Sin embargo, no observamos ningún cambio en el rendimiento de estrictasidina o subproductos de estrictasidina (Fig. 13 complementaria).

Para comparar el efecto del cloroplasto y la localización de enzimas citosólicas en los rendimientos de producción de 7-DLA y estrictosidina, agregamos (o eliminamos en el caso de GPPS/GES) un péptido de tránsito a cada enzima (Fig. 6, Datos complementarios 1). Para mejorar el flujo de precursores de isoprenoides en el citosol, nuestro objetivo era aliviar el paso limitante de la velocidad de la vía del mevalonato mediante la coinfiltración de una 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa truncada (tHMGR) de la avena, que previamente se demostró que mejora los títulos. del triterpenoide β-amirina en N. benthamiana42. Cuando todas las enzimas se localizaron en el citosol, el flujo a través de la vía secoiridoide fue mínimo (reducción de ~90 veces para 7-DLA), mientras que la localización de todas las enzimas de la vía en el cloroplasto resultó en 5 veces menos 7-DLA (Fig. 6a, Datos complementarios 1). Los mejores rendimientos de 7-DLA (Fig. 6a, Datos complementarios 1) y estrictosidina (Fig. 6b, Datos complementarios 1) se obtuvieron con la localización del cloroplasto de la vía temprana y la localización citosólica de los pasos posteriores, que imitaron el patrón de localización nativo en C. roseus. La producción de 7-DLA en el cloroplasto posiblemente esté limitada por la disponibilidad de reductasas P450 asociadas para G8H e iridoide oxidasa (IO) o sustratos de moléculas pequeñas como UDP-glucosa para 7-DLGT; sin embargo, todas las divisiones posibles de las enzimas de la ruta entre el el citosol y el cloroplasto aún producen 7-DLA, lo que indica que los intermediarios de la ruta pueden cruzar la membrana del cloroplasto.

La reubicación de los genes de biosíntesis de 7-DLA (a) y estrictosidina (b) en el citosol (azul) o el cloroplasto (verde) disminuye el rendimiento del producto. tHMGR, 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductasa truncada. Los valores y las barras de error representan la media y el error estándar de n ≥ 3 réplicas biológicas (muestras de hojas independientes).

En este trabajo, nos propusimos mejorar la producción de intermediarios biosintéticos y productos de la vía iridoide y MIA en N. benthamiana. Estudios previos han informado que, cuando se usa N. benthamiana como hospedante para la expresión heteróloga de productos naturales de terpenoides, se acumula una variedad de derivados de terpenoides, lo que potencialmente limita el uso de esta especie como chasis para la producción de algunos tipos de moléculas8,9, 10,11,12,13,14. Como se encontró en estudios anteriores, observamos aquí que los primeros intermedios biosintéticos iridoides se modificaban con frecuencia mediante la adición de azúcares de pentosa y hexosa, lo que sugiere la participación de las UGT de la familia 1 de N. benthamiana (Fig. 1 y Tabla complementaria 1). Además, aunque ya se sabe que la expresión génica se ve afectada por la agroinfiltración43, la transcriptómica comparativa reveló que la expresión de algunas UGT endógenas se modula aún más por la expresión de rutas metabólicas de monoterpenos o iridoides (Tabla complementaria 2). Esto indica que las plantas no solo responden a la infiltración de Agrobacterium, sino también a la presencia de enzimas y/o metabolitos extraños.

Aunque N. benthamiana no acumula muchos monoterpenos, estos UGT endógenos pueden estar involucrados en la biosíntesis de metabolitos decorados más grandes y, por lo tanto, pueden actuar promiscuamente en los intermediarios iridoides tempranos. Alternativamente, pueden ser parte de un mecanismo de desintoxicación de xenobióticos para proteger contra bioactivos producidos por patógenos. Razonamos que era poco probable que estas enzimas fueran esenciales y centramos los esfuerzos en mejorar el chasis de N. benthamiana identificando y eliminando la actividad de estas enzimas. Utilizamos herramientas moleculares basadas en Cas9 para introducir mutaciones de pérdida de función en 20 genes objetivo de UGT (Tabla 1 y Figs. 2–5 complementarias). Empleamos dos enfoques: la producción de plantas transgénicas que expresan constitutivamente Cas9 junto con múltiples sgRNA45 y el uso recientemente descrito de un vector viral para expresar transitoriamente sgRNA móviles en plantas que portan un transgén Cas938. Si bien pudimos recuperar líneas con mutaciones en la mayoría o en todas las líneas objetivo utilizando el método anterior, el método de sgRNA móvil, aunque menos eficiente, fue menos laborioso y se pudo escalar más fácilmente para investigar muchos genes objetivo.

En relación con las líneas de control, las plantas con mutaciones en el grupo A UGT, NbUGT94E7, ya no acumularon el pico supuestamente asignado como ácido trihexosil geránico (m/z 699,2713, [M + HCOOH-H]) (Fig. 3, Figs. 6 complementarias). y 7). Esta UGT también carece del motivo GSS propuesto como importante para definir la estructura de bucle de las monoglucosiltransferasas37,39,40,41,42,43,44,46. Además, identificamos que, en relación con las líneas de control, cuatro picos estaban disminuidos o ausentes en plantas con mutaciones en el Grupo G UGT, NbUGT85A73 (Fig. 3 y Figs. Suplementarias 6 y 7). Este UGT se informó anteriormente como activo en geraniol37. Sorprendentemente, estos picos solo se eliminaron en plantas infiltradas con todas las enzimas de la ruta requeridas para producir nepetalactol, y aún permanecieron cuando los genes de la ruta para la expresión de geraniol estaban presentes. Es probable que el hexosil hidroxigeraniol (m/z 377.1817, [M + HCOOH-H]) y el hexosil hidroxicitronelal (m/z 379.1974, [M + HCOOH-H]) se produzcan por glicosilación de 8-hidroxigeraniol y, por lo tanto, requieran la expresión de geraniol 8-oxidasa. Sin embargo, no está claro por qué la acumulación de pentosil hexosil geraniol (m/z 493.2288, [M + HCOOH-H]) y acetil dihexosil geraniol (m/z 519.22425, [MH]) se redujo solo cuando se infiltró la vía extendida.

Nuestro enfoque proporciona una prueba de concepto para la aplicación de enfoques de edición de genes para mejorar N. benthamiana como un chasis de bioproducción para moléculas pequeñas de tipo terpenoide al reducir la acumulación de derivados. Sin embargo, observamos que las mutaciones de UGT individuales redujeron cada una la acumulación de picos menores. Para lograr el impacto, se puede requerir la producción de líneas con mutaciones en múltiples genes para impactar dramáticamente el rendimiento de los metabolitos de interés. También encontramos que a medida que la ruta se extiende por la coexpresión de enzimas adicionales, se observan menos picos derivados (Figs. 1, 4 y 5). Esto sugiere que las enzimas de la ruta tienen una alta afinidad por los sustratos y, particularmente cuando se expresan a partir de promotores fuertes, es muy probable que superen a las enzimas endógenas por los sustratos. La estrictosidina es una molécula polar glicosilada que probablemente está secuestrada en la vacuola para su almacenamiento y es menos propensa a la derivatización que sus precursores iridoides hidrofóbicos. De hecho, cuando la ruta de la estrictosidina se expresó en líneas que producían menos derivados o intermediarios tempranos de la ruta, no hubo cambios en el rendimiento en comparación con la expresión en N. benthamiana de tipo salvaje (Fig. 13 complementaria).

Pudimos demostrar la producción de altas cantidades de estrictosidina (0,23 ± 0,11 mg/g DW) a partir del metabolismo central en un organismo fotosintético. También mejoramos la producción de estrictosidina al mejorar el paso clave de ciclación requerido para la formación de nepetalactol. El género de plantas Nepeta L., conocido coloquialmente como hierba gatera o hierba gatera, utiliza la primera parte de la vía secoiridoide para producir nepetalactonas. Un trabajo reciente reveló que la producción de cis-trans nepetalactol es asistida por MLPL en Nepeta41. La expresión heteróloga de MLPL de N. mussinii para ayudar con la ciclación del producto enol reactivo de ISY superó los cuellos de botella en la vía secoiridoide (Fig. 4) y fue fundamental para permitir la producción heteróloga de estrictosidina en N. benthamiana (Fig. 5). MLPL mejora de manera similar la ingeniería metabólica secoiridoide en microorganismos como la levadura31. Además, una cascada de enzimas de un solo recipiente in vitro sin células incluyó MLPL con otras nueve enzimas de la vía, proteínas accesorias y enzimas de regeneración de cofactores para producir ~1 g/l de nepetalactona42.

La vía MIA en C. roseus está muy compartimentada entre compartimentos subcelulares y tipos de células. El primer paso comprometido es la síntesis de geraniol (GES), que se localiza en el cloroplasto de las células del parénquima asociadas al floema interno47. Para aumentar la disponibilidad de sustrato para GES, expresamos conjuntamente GPPS de P. abies48, que también fue utilizado por Miettinen y colaboradores14. La expresión de PaGPPS dirigida al cloroplasto mejoró el rendimiento ~ 5 veces (Fig. 5) de acuerdo con los efectos informados anteriormente sobre la producción de geraniol13. Es de destacar que PaGPPS es casi idéntico (Fig. 14 complementaria) a un GPPS de Picea glauca que se muestra in vitro para producir niveles más altos del monoterpeno limoneno en relación con otras seis secuencias de GPPS comúnmente utilizadas en la ingeniería metabólica de terpenos49. También co-expresamos DXS de C. roseus. Curiosamente, CrDXS tuvo un efecto relativamente pequeño sobre el rendimiento de la estrictosidina en contraste con los efectos previamente informados de DXS sobre la producción de diterpenoides10,50.

Esfuerzos recientes para diseñar rutas metabólicas han encontrado beneficios al alterar la compartimentación de las enzimas de la ruta13,51. Por ejemplo, la ruta para producir el glucósido cianogénico dhurrin se trasladó al cloroplasto de Nicotiana tabacum donde la ferredoxina, reducida a través de la cadena de transporte de electrones fotosintéticos, puede servir como un donante de electrones eficiente para los dos citocromos P450 (CYP) dentro de la ruta52. Además, la localización de enzimas que codifican los últimos pasos de la ruta de la artemisinina hacia el cloroplasto en N. tabacum produjo niveles más altos de artemisinina (800 µg/g DW)53 y ácido artemisínico (~1200 µg/g DW)54 en comparación con la localización dentro el citosol (6,8 µg/g DW de artemisinina)55. Este aumento posiblemente se deba al aislamiento de metabolitos del citosol, donde pueden afectar la viabilidad y estar expuestos a derivatización no deseada por glicosiltransferasas endógenas11,12,56. La producción de indican57 halogenados y vainillina58 en N. benthamiana también se benefició de la localización del cloroplasto. Por el contrario, un informe reciente encontró que la producción de diterpenoides (típicamente sintetizados en el cloroplasto) mejoró drásticamente al cooptar la vía del mevalonato citosólico para producir GGPP en lugar de la vía del MEP del cloroplasto59.

En este estudio, encontramos que la configuración óptima para reconstruir la ruta hacia la estrictosidina dentro de las hojas de N. benthamiana es coincidir con el patrón de localización de C. roseus que utiliza la ruta MEP del cloroplasto para que los precursores de isoprenoides produzcan geraniol y luego localizar las enzimas restantes de la ruta en el citosol (Fig. 4). Presumimos que la producción de monoterpenos en el citosol es limitada ya que el GPP (10 carbonos) producido por GPPS también es el sustrato de la farnesilpirofosfato sintasa (FPPS) de N. benthamiana, que produce farnesilpirofosfato (FPP) (15 carbonos). Los datos que respaldan esta hipótesis sugieren que las cuatro copias de NbFPPS están reguladas al alza para producir fitoesteroles y fitoalexinas sesquiterpenoides en respuesta a Phytophthora infestans60. A. tumefaciens también provoca una remodelación transcripcional generalizada cuando se infiltra en N. benthamiana35. Esta competencia entre GES y FPPS también podría explicar los niveles más altos de geraniol y derivados de geraniol en el plástido informado anteriormente13. Los esfuerzos futuros para inactivar condicionalmente NbFPPS durante la producción heteróloga podrían permitir una estrategia de ingeniería metabólica que podría aprovechar tanto la ruta citosólica como la plástida para la producción de geraniol.

En C. roseus, el geraniol se difunde o se transporta desde el plástido hacia el citosol para reaccionar con G8H, que está anclado al exterior de la membrana del RE. Los siguientes pasos (G8H a ácido desoxilogánico hidroxilasa (7-DLH)) están activos en el citosol de las células del parénquima asociadas al floema con dos CYP (G8H e IO) también anclados a la membrana del RE14. Luego, el ácido logánico es transportado por NPF2.4/5/661 a las células epidérmicas, donde cuatro enzimas más (LAMT a la estrictosidina sintasa (STR)) producen estrictosidina62,63. La triptamina y la secologanina se importan a la vacuola, donde se sintetiza y acumula estrictosidina con exportación de estrictosidina mediada por el transportador NPF2.964. Por lo tanto, es probable que cuatro vías de CYP (G8H, IO, 7-DLH y secologanina sintasa) interactúen con las CYP reductasas endógenas de N. benthamiana para la transferencia de electrones de NADPH a las CYP. Es posible que las CYP reductasas necesarias sean menos abundantes en el cloroplasto y limiten así la acumulación de estrictosidina en este compartimento. También es posible que los CYP450 estén mal anclados a la membrana o que un pH estromal más alto del cloroplasto (~8,0)65 inhiba la actividad enzimática en comparación con el citosol (pH ~7,0). También consideramos la falta de un cofactor adicional para LAMT, S-adenosilmetionina (SAM) para explicar los bajos niveles de producción de estrictosidina (en relación con 7-DLA) en el cloroplasto. Sin embargo, se sabe que esta pequeña molécula se transporta activamente al plástido66 y es un sustrato esencial para ChlM (Mg-protoporfirina IX metiltransferasa) involucrada en la biosíntesis de clorofila dentro del cloroplasto.

La producción de estrictosidina in planta abre nuevas vías para producir una gran cantidad de productos MIA mediante síntesis biológica. Aunque el metabolismo endógeno de esta especie es perjudicial para la acumulación de monoterpenos, permite la acumulación de moléculas complejas. En particular, a medida que se descubren nuevas vías de biosíntesis para MIA adicionales (p. ej., el compuesto antiadictivo ibogaína67, la quinina antipalúdica68), la posibilidad de acoplar este trabajo de manera plug-and-play con módulos de biosíntesis aguas abajo es una perspectiva emocionante para los productos naturales. síntesis.

Los vectores binarios para la expresión transitoria mediada por Agrobacterium tumefaciens (agroinfiltración) se ensamblaron mediante la clonación de secuencias de codificación amplificadas a partir del ADNc de C. roseus en el vector pEAQ-HT-DEST1 (GenBank GQ497235, Tabla complementaria 4)69 o se ensamblaron en construcciones de expresión usando la planta kit de herramientas de clonación modular (MoClo)70. Para este último, se sintetizaron secuencias de codificación (Twist Bioscience, San Francisco, CA) eliminando cualquier secuencia de péptido de tránsito de cloroplasto nativo, así como cualquier instancia de sitios de reconocimiento BpiI, BsaI, BsmBI y SapI mediante la introducción de mutación sinónima o amplificación de C cDNA de .roseus por PCR con salientes que contienen sitios de reconocimiento BpiI (BbsI). Los amplicones se clonaron en pUAP1 (Addgene n.° 63674) como se describió anteriormente71, lo que resultó en partes de nivel 0 (Addgene n.° 177019 - 177032) flanqueadas por un par invertido de sitios de reconocimiento de BsaI que producen voladizos compatibles con el estándar de ensamblaje de fitobricks72 (Tabla complementaria 5). Estas partes de nivel 0 se ensamblaron en aceptores de nivel 1 en una reacción de clonación de un solo paso71 con partes de nivel 0 que codifican el promotor CaMV 35 s (CaMV35s) y 5' UTR del virus del mosaico del tabaco (TMV) y, cuando se requiere, un tránsito de cloroplasto sintético secuencia peptídica (Tabla complementaria 6) para alterar la localización subcelular.

Las plantas de N. benthamiana se cultivaron en una habitación de ambiente controlado con 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad con una habitación a 22 °C, 80 % de humedad y una intensidad de luz de ~200 µmol/m2/s. Electrocompetente A. tumefaciens GV3101 (vectores MoClo) o LBA4404 (vectores pEAQ) se transformaron con el plásmido binario que codifica el gen de interés y se utilizó una colonia individual para inocular medio LB líquido que contenía antibióticos rifampicina 50 μg/mL, gentamicina 20 μg/mL , y 100 μg/mL de carbenicilina (vectores MoClo) o 50 μg/mL de rifampicina, 100 μg/mL de estreptomicina y 50 μg/mL de kanamicina (vectores pEAQ). Los cultivos saturados durante la noche se centrifugaron a 3400 × g durante 30 min a temperatura ambiente y las células se resuspendieron en medio de infiltración (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) 10 mM pH 5,7, MgCl2 10 mM, 3′,5 200 µM '-dimetoxi-4'-hidroxiacetofenona (acetosiringona)) y se incuba a temperatura ambiente durante 2-3 h con agitación lenta. Todos los cultivos resuspendidos se diluyeron a 0,8 OD600nm (MoClo) o 0,5 OD600nm (pEAQ) y se mezclaron en proporciones iguales según lo dictado por las condiciones experimentales. Para los vectores MoClo, se incluyó en cada infiltración una cepa separada de A. tumefaciens que codifica un gen que expresa el supresor P19 del silenciamiento génico del virus del acrobacia arbustiva del tomate (TBSV) que previamente demostró aumentar la expresión heteróloga69. Se infiltraron plantas sanas (de 29 a 37 días de edad) con 3 o 4 hojas verdaderas completamente expandidas en el lado abaxial de la hoja con una jeringa sin aguja de 1 ml y se cultivaron durante cinco días en una cámara de crecimiento de plantas MLR-352-PE (Panasonic Healthcare Co, Oizumi-Machi, Japón) con 16 horas de luz, 8 horas de oscuridad a 22 °C y una intensidad de luz de 120–180 µmol/m2/s. Todos los compuestos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Cinco días después de la infiltración, se recogieron 100–300 mg de tejido foliar infiltrado de N. benthamiana en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. El tejido de la hoja se liofilizó durante la noche usando un secador por congelación VirTis BenchTop SLC (SP Industries, Stone Ridge NY, EE. UU.) ajustado a -49 °C y 300 mTorr. A continuación, las muestras se molieron hasta convertirlas en polvo usando una perla de carburo de tungsteno de 3 mm (Qiagen Cat. No. / ID: 69997) en un TissueLyser II (Qiagen, Hilden, Alemania) ajustado a 20 Hz durante 20 segundos. El tejido de hoja liofilizado se extrajo con metanol al 70 % + ácido fórmico al 0,1 % (1:100, wv). El disolvente contenía 10 µM de harpagoside (Extrasynthese, Genay, Francia) como patrón interno. Las extracciones se realizaron a temperatura ambiente durante 1 h, con sonicación durante 10 min y agitación constante durante 50 min. Las muestras se centrifugaron a 17 000 × g durante 10 min para separar los desechos y se filtraron a través de filtros de disco de PTFE de 0,2 µm antes del análisis de cromatografía líquida de espectrometría de masas de ultra alto rendimiento (UPLC/MS).

El análisis UPLC/MS se realizó en un espectrómetro de masas Impact II qTOF (Bruker) acoplado a un sistema cromatográfico Elute UPLC (Bruker). La separación cromatográfica se llevó a cabo en una columna Phenomenex Kinetex XB-C18 (100 × 2,10 mm, tamaño de partícula de 2,6 μm) mantenida a 40 °C y el sistema solvente binario consistió en el solvente A (H2O + 0,1% de ácido fórmico) y el solvente B ( acetonitrilo). El caudal fue de 600 μL/min. La columna se equilibró con 99 % de A y 1 % de B. Durante el primer minuto de cromatografía, el disolvente B alcanzó el 5 %. Luego, un gradiente lineal de 5% B a 40% B en 5 min permitió la separación de los compuestos de interés. A continuación, la columna se lavó con B al 100 % durante 1,5 min y se volvió a equilibrar con B al 1 %. El volumen de inyección fue de 2 μL. La espectrometría de masas se realizó tanto en modo de iones positivos como negativos con un rango de exploración m/z 100–1000. El espectrómetro de masas se calibró utilizando aductos de formiato de sodio. Los ajustes de la fuente fueron los siguientes: voltaje capilar 3,5 kV, nebulizador 2,5 bar, gas seco 11,0 L/min, temperatura seca 250 °C. El análisis de datos se realizó utilizando el software Bruker Data Analysis. La cuantificación de ácido 7-desoxilogánico (7-DLA), loganina, ácido logánico y estrictosidina se basó en curvas de calibración generadas usando compuestos puros. La loganina y el ácido logánico se adquirieron de Sigma. El ácido 7-desoxilogánico y la estric- tosidina se sintetizaron como se describió previamente73,74. Los estándares se diluyeron en metanol al 70 % + ácido fórmico al 0,1 % para dar nueve calibradores con concentraciones entre 40 nM y 10 µM. Se observó una respuesta lineal para todos los compuestos en este rango de concentraciones (R2 > 0,993). La identificación putativa de metabolitos se basó en la adquisición de datos de espectrometría de masas de alta resolución para determinar la composición elemental más adecuada utilizando el software de análisis de datos (Bruker).

Los experimentos de agroinfiltración se realizaron como se describió anteriormente con cuatro conjuntos de vectores pEAQ: (1) geraniol bajo (GFP, CrGES), (2) geraniol alto (GFP, CrDXS, CrGGPPS.LSU, CrGES), (3) nepetalactol (GFP, CrDXS , CrGGPPS.LSU, CrGES, CrG8H, Cr8HGO, CrISY), y (4) un control de infiltración (solo GFP) (Tabla complementaria 7). El tejido de la hoja de tres réplicas biológicas de cada condición y un control infiltrado simulado se recolectaron cinco días después de la infiltración y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. El ARN total se aisló utilizando el mini kit de plantas RNeasy (Qiagen) con tratamiento con ADNasa I recombinante (Roche). Las bibliotecas se construyeron en una estación de trabajo Sciclone® G3 NGSx (PerkinElmer, Waltham, MA) usando el protocolo TruSeq RNA v2 (Illumina 15026495 Rev.F). La calidad del ARN se evaluó con el kit de ensayo de ARN Quant-iT™ (Life technologies/Invitrogen Q-33140). Se purificó 1 µg de ARN para extraer el ARNm poliadenilado utilizando perlas de biotina, se fragmentó y cebó con hexámeros aleatorios para producir la primera cadena de ADNc seguido de la síntesis de la segunda cadena para producir dscADN. Los extremos de la muestra se hicieron romos y se ligaron los adaptadores de indexación y la cola A con los voladizos en T correspondientes. Los productos ligados se seleccionaron por tamaño y los adaptadores no ligados se retiraron utilizando perlas XP (Beckman Coulter A63880). Las muestras se amplificaron con un cóctel de cebadores de PCR para los adaptadores. El tamaño del inserto de las bibliotecas se verificó con LabChipGX (PerkinElmer 5067–4626) y reactivos de ADN de alta sensibilidad de ADN (PerkinElmer CLS760672). Se agruparon cantidades equimolares de cada biblioteca, cinco bibliotecas por grupo, y se secuenciaron en un carril de un HiSeq 2500 generando lecturas de extremos emparejados de 100 pares de bases. El análisis de datos se realizó utilizando una interfaz Galaxy basada en la web (https://galaxy.earlham.ac.uk)75. El borrador del ensamblaje del genoma de N. benthamiana v0.5 http://benthgenome.qut.edu.au/76 se amplió para incluir el genoma y los plásmidos de Agrobacterium C58 (Genbank AE007869.2, AE007870.2, AE007871.2 y AE007872 .2), así como los vectores pEAQ utilizados para la infiltración (Tabla complementaria 4). Todas las lecturas cortas de RNA-seq se asignaron al genoma expandido utilizando los parámetros predeterminados de hisat2 v2.1.0. Las transcripciones ensambladas se generaron utilizando Stringtie v1.3.3.1. Las transcripciones de n = 15 muestras experimentales se consolidaron utilizando Stringtie merge v1.3.3. Todas las lecturas cortas se alinearon nuevamente con el genoma expandido (esta vez con el transcriptoma fusionado como referencia) usando hisat2 v2.1.0. Las tablas de expresiones diferenciales se generaron utilizando DESeq2 v2.11.40.1. Las transcripciones del transcriptoma fusionado se tradujeron con transdecoder y las secuencias de codificación más largas se anotaron con phmmer v3.1v2 con la base de datos de proteínas Swiss-Prot (consultada en mayo de 2018) como referencia.

Se analizaron los transcritos de N. benthamiana que codifican secuencias anotadas como glicosiltransferasas de la familia 1 (GT1, familia de proteínas (Pfam) PF0201 o PF3033), lo que dio como resultado 77 secuencias > 327 aminoácidos e incluyó una caja de glicosiltransferasa de producto secundario vegetal (PSPG) intacta. Las secuencias de proteínas de 107 UGT de Arabidopsis thaliana se obtuvieron del sitio de citocromo P450, citocromo b5, P450 reductasa, b-glucosidasa y glicosiltransferasa de A. thaliana (http://www.p450.kvl.dk) como se describe33. Se informó previamente que otras 9 secuencias UGT tienen actividad en geraniol u otros sustratos iridoides de Actinidia deliciosa (kiwi)77, Camellia sinensis (té)78, C. roseus79, Gardenia jasminoides (Jazmín del Cabo)80, Sorghum bicolor81, Vitis vinifera (uva )82,83 también fueron incluidos. Las secuencias y los números de acceso se enumeran en la Tabla complementaria 8. Las 193 secuencias se alinearon con MUSCLE 3.8.425 (Edgar 2004) y se generó un árbol filogenético con 100 arranques con RAxML versión 8.2.1184 dentro del programa Geneious. Los árboles filogenéticos se visualizaron utilizando Interactive Tree Of Life (iTOL)85.

Los vectores binarios que expresan Cas9 y los ARN de guía única (sgRNA) para los objetivos deseados se ensamblaron utilizando el kit de herramientas de clonación modular de plantas71 como se describió anteriormente45. En resumen, los cebadores que codifican el espaciador de sgRNA deseado (Tabla complementaria 9) se usaron para amplificar por PCR el andamio de extensión de tallo de sgRNA informado por Chen y colaboradores86. El amplicón de PCR resultante se ensambló con una parte de nivel 0 que codifica un promotor U6–26 de Arabidopsis (AtU6–26 Addgene#68261) o un promotor U6 de N. benthamiana (NbU6-1 Addgene#185623 y NbU6-2 Addgene#185624) ( Tabla complementaria 9). Los promotores U6 de N. benthamiana se identificaron por homología de secuencia con Arabidopsis U6–26 y la eficacia se confirmó mediante infiltración transitoria como se describió anteriormente45. Las construcciones de Nivel 1 resultantes se ensamblaron con genes sintéticos que confieren resistencia a la kanamicina y para la expresión constitutiva de Cas9 (Fig. 15 complementaria). La eficacia de los sgRNA se confirmó mediante infiltración transitoria como se describió anteriormente45. Las construcciones resultantes se transformaron en la cepa AGL1 hipervirulenta de A. tumefaciens para la transformación de plantas. Se usó una colonia individual para inocular 10 mL de medio LB con antibióticos (50 μg/mL de kanamicina y 50 μg/mL de rifampicina). Los cultivos saturados durante la noche se centrifugaron a 3000 × g durante 10 min a temperatura ambiente y las células se resuspendieron en 10 ml de medio MS con acetosiringona 100 μM y densidad óptica OD600 ajustada a 0,6-0,8. N. benthamiana se transformó como se informó anteriormente87 con ligeras modificaciones. Se recolectaron hojas jóvenes de plantas sin flores de 4 semanas de edad y se esterilizaron superficialmente. Se inocularon cuadrados de 1-2 cm con Agrobacterium durante cinco minutos a temperatura ambiente, se secaron con papel de filtro estéril y se colocaron con el lado abaxial hacia abajo en medios de cocultivo pH 5,8 que contenían sal basal MS88, vitaminas B5 de Gamborg89, 3 % (p/v) sacarosa, 0,59 g/L de hidrato de MES, 6 g/L de agarosa, 6-bencilaminopurina (BAP, 1,0 mg/L) y ácido naftalenoacético (NAA, 0,1 mg/L). Los explantes se cocultivaron durante 3 días bajo luz fluorescente blanca (16 h de luz/8 h de oscuridad) a 22 ± 2 oC y luego se transfirieron a un medio de selección que contenía sales basales de MS, vitaminas B5 de Gamborg, sacarosa al 3 % (p/v), 0,59 g/L de hidrato de MES, 6 g/L de Agargel, 6-Bencilaminopurina (BAP, 1,0 mg/L) y ácido naftalenoacético (NAA, 0,1 mg/L), 100 mg/L de kanamicina y 320 mg/L de ticarcilina. Los explantes se subcultivaron en medio de selección fresco a intervalos de 14 días. Los brotes transgénicos putativos se cultivaron en medios de enraizamiento que contenían sales de MS con vitaminas (fuerza media), suplementados con 1 mg/L de ácido indol-3-butírico, 0,5 % de sacarosa, 0,3 % de Gelrite, 100 mg/L de kanamicina y 320 mg/L de ticarcilina. . Las plántulas se transfirieron a bloques de turba estériles (Jiffy7) en recipientes MagentaTM (Sigma), antes de trasplantarlas a compost a base de turba (90 % turba, 10 % arena, 4 kg/m3 de caliza dolomítica, 0,75 kg/m3 de fertilizante compuesto (PG Mix ™), 1,5 kg/m3 de fertilizante de liberación controlada (Osmocote Bloom)) y se transfirió a un invernadero.

Un vector de plásmido TRV2 SPDK3888 (Addgene #149276) fue recibido con agradecimiento de Savithramma Dinesh-Kumar y Dan Voytas. Esto se modificó añadiendo sitios de restricción AarI y un casete lacZ para producir pEPQD0KN0750 de selección (Addgene#185627). Las secuencias espaciadoras para objetivos seleccionados se incorporaron en pEPQD0KN0750 mediante ensamblaje Golden Gate en sitios AarI como se describió previamente38 (Tabla complementaria 10). Las construcciones se transformaron en A. tumefaciens GV3101 y se usó una colonia individual para inocular medio LB que contenía 50 μg/mL de rifampicina, 20 μg/mL de gentamicina y 50 μg/mL de kanamicina y se cultivaron durante la noche con agitación a 28 °C. Los cultivos saturados se centrifugaron y se resuspendieron en medio de infiltración como se describe anteriormente, excepto que los cultivos se diluyeron a 0,3 OD600nm y las cepas de Agrobacterium se mezclaron en proporciones iguales con una cepa que contenía pTRV1 (Addgene #148968). Dan Voytas recibió con agradecimiento semillas de plantas transgénicas de N. benthamiana que expresan constitutivamente Cas9 (Cas9 Benthe 193.22 T5 Homocigoto) y se cultivaron durante 6 semanas en un invernadero a 22 ± 2 °C. Las plantas se infiltraron como se describe anteriormente y se dejaron crecer durante 13 semanas antes de tomar muestras de tejido foliar de dos tallos diferentes (designados A y B).

Se recolectaron muestras de 40–60 mg de tejido foliar de plantas T0 generadas por transformación estable mediada por agrobacterium o de hojas muestreadas de dos tallos de plantas infiltradas con virus de ARN que expresan sgRNA móviles. El ADN genómico se aisló como se describió previamente45. Los loci objetivo se amplificaron utilizando una polimerasa de lectura de pruebas (ADN polimerasa de alta fidelidad Q5®, New England Biolabs, Ipswich, MA) y cebadores que flanquean los sitios objetivo (Tabla complementaria 11). Los amplicones se secuenciaron mediante secuenciación de Sanger (Eurofins, Luxemburgo). Los amplicones con múltiples picos que sugerían la presencia de quimerismo genético, mutaciones heterocigóticas o bialélicas se resolvieron mediante la clonación de amplicones en Zero Blunt™ TOPO™ (Thermo Fisher, Waltham, MA) o pGEM®-T Easy (Promega, Madison, WI) seguido de la secuenciación de plásmidos aislados de 10 a 15 colonias. Para las plantas generadas por transformación estable mediada por agrobacterium, el número de copias de T-DNA de las plantas T0 se estimó mediante ddPCR como se describió anteriormente90 utilizando cebadores para nptII y el gen de referencia de copia única Rdr191. Se recolectaron semillas T1 de plantas de una sola copia con mutaciones homocigotas, heterocigotas o bialélicas en ubicaciones objetivo y se cultivaron para análisis posteriores. Para las plantas generadas con virus de ARN y sgRNA móviles, las semillas (designadas como E1) se recolectaron de vainas individuales en el extremo distal de los tallos en los que se detectaron mutaciones. Se cultivaron T1 y E1 y se confirmó el genotipo de cada loci diana como anteriormente.

Se utilizó un mínimo de n = 3 réplicas biológicas para el análisis del transcriptoma, la evaluación de los picos derivados en plantas mutadas y la cuantificación del rendimiento. Se repitieron experimentos clave, incluida la cuantificación de ácido 7-desoxilogánico (7-DLA) y estrictosidina, de modo que n = 6 o n = 11. Los cambios en el rendimiento se analizaron mediante ANOVA unidireccional con Tukey HSD post-hoc. No se excluyeron datos. La disposición de las muestras agroinfiltradas en las hojas se aleatorizó entre las hojas y entre las plantas dentro de un experimento dado. Para la identificación de los derivados y la cuantificación de los productos de metabolitos, el diseño experimental, la infiltración de hojas y la recolección de muestras fueron realizados por un investigador y las muestras fueron analizadas a ciegas por otro investigador.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Se han depositado secuencias y muestras de ADN de plásmidos en Addgene (#177019 - #177092). Los datos del transcriptoma se han depositado en la base de datos del archivo de lectura de secuencias del NCBI con el ID de proyecto PRJNA841421. Los datos de origen numéricos para todos los gráficos se proporcionan en Datos complementarios 1.

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Descargar referencias

Agradecemos a Benjamin Lichman por su orientación sobre cómo trabajar con MLPL. También agradecemos a Nicola Soranzo por su ayuda con el análisis de RNAseq dentro de Galaxy y a Yaomin Cai por su ayuda con la gestión y el envío de datos. pL0-AstHMGR fue un generoso regalo de Anne Osbourn. Los plásmidos pNJB069 (pTRV1), pEE393 y pEE515 junto con las semillas de N. benthamiana que expresan SpCas9 fueron un generoso regalo de Dan Voytas. La preparación y secuenciación de la biblioteca se realizó a través de la capacidad nacional en genómica y análisis de células individuales de BBSRC (BBS/E/T/000PR9816) en el Instituto Earlham por miembros del Grupo de tuberías de genómica. También agradecemos a Lesley Phillips, Catherine Taylor y JIC Horticultural Services por su ayuda con el cuidado de las plantas. Los autores agradecen el apoyo del Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC) parte de Investigación e Innovación del Reino Unido. Esta investigación fue financiada por la subvención del programa estratégico central BBSRC BB/CSP1720/1 y su paquete de trabajo constituyente BBS/E/T/000PR9819 Interacciones regulatorias y fenotipos complejos y por un premio de asociación industrial con Leaf Expression Systems (BB/P010490/1) . SOC también reconoce el apoyo de la Sociedad Max Planck y el Consejo Europeo de Investigación (ERC 788301). Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Nathaniel H. Sherden

Dirección actual: Octagon Therapeutics Ltd, 700 Main Street, North Cambridge, MA, 02139, EE. UU.

Ingeniería Biológica, Instituto Earlham, Parque de Investigación de Norwich, Norwich, Norfolk, NR4 7UZ, Reino Unido

Quentin M. Dudley, Seohyun Jo y Nicola J. Patrón

Departamento de Biosíntesis de Productos Naturales, Instituto Max Planck de Ecología Química, Jena, 07745, Alemania

Delia Ayled Serna Guerrero, Sarah E. O'Connor y Lorenzo Caputi

Centro John Innes, Parque de Investigación de Norwich, Norwich, NR4 7TJ, Reino Unido

Monika Chhetry, Mark A. Smedley, Wendy A. Harwood y Nathaniel H. Sherden

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QMD, SEO, LC y NJP concibieron el estudio. QMD realizó el ensamblaje de ADN y la expresión transitoria con la ayuda de SJNHS construyó y realizó experimentos de infiltración con vectores pEAQ. QMD realizó un análisis transcriptómico, reunió todos los vectores para la mutagénesis, entregó virus de ARN para la mutagénesis y realizó la genotipificación. MC y MAS realizaron todo el cultivo de tejidos vegetales con la supervisión de WAHDASG y LC realizó la extracción y el análisis de metabolitos. QMD, SEO, LC y NJP escribieron el manuscrito. SEO y NJP obtuvieron financiación y proporcionaron supervisión.

Correspondencia a Lorenzo Caputi o Nicola J. Patrón.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Dudley, QM, Jo, S., Guerrero, DAS et al. Reconstitución de la biosíntesis de alcaloides de indol monoterpeno en Nicotiana benthamiana modificada por ingeniería genómica. Comun Biol 5, 949 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03904-w

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Recibido: 04 julio 2022

Aceptado: 25 de agosto de 2022

Publicado: 10 septiembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03904-w

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