Evaluación de genotipos, endosimbiontes y características clínicas de Acanthamoeba recuperados de infección ocular

BMC Infectious Diseases volumen 22, Número de artículo: 757 (2022) Citar este artículo

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Acanthamoeba es un patógeno emergente, infame por su resistencia contra compuestos antiprotozoarios, desinfectantes y entornos hostiles. Se sabe que causa queratitis, una infección de la córnea que amenaza la vista, es dolorosa y difícil de tratar y que a menudo se informa entre los usuarios de lentes de contacto y los pacientes con traumatismos oculares. Acanthamoeba comprende más de 24 especies y actualmente se han identificado 23 genotipos (T1-T23).

Este estudio retrospectivo fue diseñado para examinar las especies y genotipos de Acanthamoeba recuperados de pacientes con queratitis por Acanthamoeba (AK), determinar la presencia de endosimbiontes en aislamientos oculares de Acanthamoeba y revisar las presentaciones clínicas.

En este estudio se incluyeron trece pacientes con QA confirmados por cultivo tratados en un centro de atención oftalmológica terciaria en Hyderabad, India, de febrero a octubre de 2020. Las manifestaciones clínicas, medicamentos y resultados visuales de todos los pacientes se obtuvieron de las historias clínicas. Los aislados de Acanthamoeba se identificaron secuenciando el gen de la subunidad nuclear ribosomal (rns). Se evaluó la presencia de endosimbiontes bacterianos o fúngicos en aislamientos de Acanthamoeba mediante ensayos moleculares, PCR e hibridación fluorescente in situ (FISH).

La edad media de los pacientes fue de 33 años (DE ± 17,4; IC 95% 22,5 a 43,5 años). Seis (46,2%) casos tenían factores de riesgo asociados a la QA; cuatro pacientes tenían trauma ocular y dos eran usuarios de lentes de contacto. A. culbertsoni (6/13, 46,2%) fue la especie más común, seguida de A. polyphaga y A. triangularis. La mayoría de los aislamientos (12/13) pertenecían al genotipo T4 y uno era T12; se identificaron tres subgrupos T4A, T4B y T4F dentro del genotipo T4. No hubo una asociación significativa entre los tipos de Acanthamoeba y los resultados clínicos. Ocho (61,5%) aislamientos albergaban bacterias intracelulares y uno contenía Malassezia restricta. La presencia de microbios intracelulares se asoció con una mayor proporción de infiltrados estromales (88,9 %, 8/9), defecto epitelial (55,6 %, 5/9) e hipopión (55,6 %, 5/9) frente al 50 % (2/ 4), 25% (1/4) y 25% (1/4) de casos de QA sin microbios intracelulares, respectivamente.

El genotipo T4 fue el aislado predominante en el sur de la India. Este es el segundo informe del genotipo T12 identificado en un paciente con QA en la India, que rara vez se informa en todo el mundo. La mayoría de los aislamientos clínicos de Acanthamoeba en este estudio albergaban microbios intracelulares, lo que puede afectar las características clínicas de la QA.

Informes de revisión por pares

La queratitis por Acanthamoeba (AK) es una enfermedad ocular rara que representa el 2% de las infecciones corneales mundiales [1]. Sin embargo, quizás debido al aumento en el uso de lentes de contacto y al aumento de la prevalencia de especies de Acanthamoeba en diferentes recursos hídricos, incluidas piscinas artificiales e incluso suministros de agua domésticos tratados [2], los casos de QA están aumentando en todo el mundo. El uso de lentes de contacto está aumentando en todo el mundo en parte debido al desarrollo de lentes de contacto que pueden controlar la progresión de la miopía en los niños, y esto puede ponerlos en riesgo de desarrollar infecciones por QA que pueden conducir a la ceguera [3]. El vínculo entre la QA y el uso de lentes de contacto está firmemente establecido, ya que el uso de lentes de contacto se asocia con casi el 90 % de las infecciones notificadas [4]. Los brotes informados se han relacionado con soluciones desinfectantes para lentes de contacto ineficaces [5, 6]. El ciclo de vida de Acanthamoeba incluye un trofozoíto infeccioso y la etapa de quiste latente; siendo este último capaz de permanecer viable durante varios años [7].

La QA es difícil de diagnosticar y existen regímenes de tratamiento efectivos muy limitados [8, 9]. Los quistes de Acanthamoeba son resistentes a los desinfectantes, a los medicamentos antiprotozoarios y al agotamiento de los nutrientes, lo que representa un desafío formidable para el cuidado del paciente [10]. Además, muchos de los medicamentos comunes para tratar infecciones oculares no son efectivos para Acanthamoeba. Como el diagnóstico y el manejo de los pacientes con QA son difíciles, esto puede conducir a una medicación prolongada y el tratamiento exitoso se vuelve extremadamente difícil y conduce a una pérdida sustancial de la visión [11]. Se necesitan intervenciones quirúrgicas en el 30% de los pacientes con QA para controlar la enfermedad y, en casos raros, se extirpa el ojo infectado [12]. Además, los quistes de Acanthamoeba son difíciles de erradicar una vez que se ha establecido la infección, y esto puede dar lugar a la recurrencia de la infección [13]. El diagnóstico correcto es esencial para una terapia exitosa, pero como los signos y síntomas clínicos de la QA varían y algunos son similares a otras infecciones oculares como la queratitis por el virus del herpes simple (VHS), el diagnóstico puede ser un desafío. Es probable que se receten analgésicos, antiinflamatorios y compuestos antimicrobianos generales mientras se establece el diagnóstico. El uso previo de corticosteroides tópicos antes del diagnóstico de infección corneal por Acanthamoeba se asocia con un peor resultado visual [14]. La QA con sospecha de resistencia a las soluciones de lentes de contacto multipropósito y los remedios antiamebales establecidos requieren modalidades de diagnóstico sensibles con enfoques terapéuticos novedosos [15].

Con base en la morfología celular, que puede verse influenciada por las condiciones de cultivo y la fuente de aislamiento, Acanthamoeba spp. se clasifican en 3 grupos, y las cepas que causan queratitis pertenecen más comúnmente al grupo II [7]. Se han identificado al menos 23 genotipos (T1-T23) basados en la secuencia del gen 18S rRNA de Acanthamoeba y las especies comunes que causan queratitis como A. castellani y A. polyphaga son del clado T4 [16]. Los genotipos T2, T3, T5, T6, T10, T11, T12, T13, T15 y T16 también se han recuperado de pacientes con QA, aunque con menos frecuencia [17,18,19]. Las variaciones entre cepas en la secuencia del gen de la subunidad rRNA (rns) 18S de Acanthamoeba se pueden utilizar para identificar genotipos subgenéricos [20].

Acanthamoeba es un protista heterótrofo que puede albergar bacterias, hongos y virus gigantes [21, 22]. Las coinfecciones de Acanthamoeba con otros patógenos como Fusarium spp. o Pseudomonas aeruginosa se han observado en pacientes con queratitis [23]. Estas coinfecciones podrían deberse al transporte intracelular de estos patógenos dentro de la Acanthamoeba infectante. Además, Acanthamoeba puede actuar como campo de entrenamiento para que los patógenos bacterianos invadan las células eucariotas superiores [24]. Lo que no se sabe es cómo estos microorganismos intracelulares afectan el tratamiento y los resultados de la enfermedad de QA, pero los estudios han informado que la presencia de microbios intracelulares aumenta la patogenicidad de los aislamientos de Acanthamoeba [25, 26]. En el presente estudio, se examinaron 13 aislamientos de Acanthamoeba recuperados de pacientes con QA en el sur de la India para medir la distribución epidemiológica de los genotipos y subgenotipos de Acanthamoeba rns y sus manifestaciones clínicas. Se evaluó la presencia de bacterias y hongos intracelulares en aislamientos de Acanthamoeba y se determinaron si estaban asociados con los resultados clínicos de los pacientes con QA.

Se realizó un estudio de serie de casos retrospectivo en un hospital a partir de registros hospitalarios y cepas de Acanthamoeba aisladas en el LV Prasad Eye Institute (LVPEI), Hyderabad, India, de febrero a octubre de 2020. Este protocolo de estudio fue revisado y aprobado por la junta de revisión institucional de LVPEI, Hyderabad (LEC-BHR-R-09–21-758). En este estudio se incluyeron trece aislamientos de Acanthamoeba recuperados de pacientes con QA.

Durante el período de estudio, según el protocolo institucional, todos los pacientes que presentaban características clínicas de queratitis microbiana se sometieron a un examen completo con lámpara de hendidura para investigar el defecto del epitelio corneal, el tamaño del infiltrado (si está presente), el tamaño del hipopión, la afectación de la esclerótica, ausencia/presencia de partículas extrañas y documentación del estado de los anexos oculares [27]. La investigación microbiológica de los raspados corneales incluyó la preparación de frotis para microscopía usando tinción de Gram e hidróxido de potasio con preparación de blanco de calcoflúor (KOH + CFW), e inoculación en medios apropiados [agar sangre de carnero al 5% (BA), agar chocolate (CA), agar Sabouraud agar dextrosa (SDA), agar papa dextrosa (PDA), agar sin nutrientes con Escherichia coli (NNA), caldo de tioglicolato y caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI)]. El frotis y la inoculación de todos los medios fueron realizados (como es estándar) por el médico tratante en la lámpara de hendidura. Los medios de cultivo deshidratados fueron suministrados por HiMedia, Mumbai, India y recién preparados internamente para su uso. Las lentes de contacto de vendaje (2/13) se cortaron asépticamente en pequeños trozos y se inocularon en BA, CA, SDA, NNA y BHI en el laboratorio de microbiología. Todos los medios se incubaron aeróbicamente a 37 °C excepto SDA y PDA a 27 °C y agar chocolate que se incubó en CO2 al 5 % a 37 °C. Los medios se observaron durante 14 días para detectar cualquier crecimiento. Los aislamientos de Acanthamoeba del raspado corneal de 13 pacientes se confirmaron mediante la observación de trofozoítos activos y quistes poligonales de doble pared; los aislamientos confirmados se conservaron en NNA y se transportaron a la Escuela de Optometría y Ciencias de la Visión, Facultad de Medicina y Salud, UNSW, Sydney, Australia. La termotolerancia de los aislados se evaluó cultivando aislados a 28 °C, 37 °C, 40 °C y 42 °C. Después del aislamiento inicial, las cepas de Acanthamoeba se cultivaron axénicamente en medio de glucosa de levadura con peptona (PYG) [28]. Cada placa de cultivo fue monitoreada para asegurar que no hubiera microbios extracelulares o contaminación. Para evitar una posible contaminación, el medio de cultivo se reemplazó con PYG recién preparado cada dos días hasta que se recolectaron los trofozoítos. Además, para este estudio se utilizó una incubadora estéril separada a 32 °C.

Las cepas de Acanthamoeba se identificaron además mediante el ensayo de PCR. Las células amebianas cultivadas en NNA se recogieron en 500 µl de PBS 1X (NaCl 1,4 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM y KH2PO4 1,8 mM, pH 6,9) usando un raspador estéril (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.). El ADN genómico (ADNg) se extrajo usando solución de lisis Chelex al 10 % v/v (Bio-Rad, CA, EE. UU.) en Triton X-100 al 0,1 % v/v (Sigma-Aldrich) y tampón Tris, pH 8,0 (Thermo Fisher Scientific, Bedford, EE. UU.), como se explicó anteriormente [29]. La cantidad de dsDNA extraído se midió con el espectrofotómetro Nano Drop UV-Vis (Thermo Fisher Scientific) y los viales de gDNA se almacenaron a -20 °C hasta su uso posterior.

La región del gen rns del ARNr 18S se amplificó en una reacción de PCR utilizando cebadores específicos del género Acanthamoeba, JDPFw (5'-GGCCCAGATCGTTTACCGTGAA-3') y JDPRv (5'-TCTCACAAGCTGCTAGGGGAGTCA-3'), que codifican la región DF3 altamente variable y dan amplicones de ~ 450 pb [30]. Cada ensayo de PCR se realizó en 12,5 µL de DreamTaq Master Mix (DNA Polymerase, 2X DreamTaq buffer, dATP, dCTP, dGTP y dTTP: 0,4 mM cada uno y 4 mM MgCl2; Thermo Fisher Scientific), 1 µL de cada cebador (10 µM) , 6,5 µL de agua de grado molecular y 4 µL de plantilla de ADN. La amplificación por PCR se llevó a cabo en un termociclador T100 de 96 pocillos (Bio-Rad, California, EE. UU.) utilizando las siguientes condiciones de termociclado: 95 °C durante 5 min para la desnaturalización inicial, seguido de 35 ciclos de amplificación (94 °C para 30 s, 56 °C por 30 s y 72 °C por 45 s) y una extensión final a 72 °C por 10 min [31]. Las amplificaciones de PCR se observaron mediante electroforesis de alícuotas de productos de PCR de 4 μL en gel de agarosa al 1 % y las bandas de amplicón se examinaron utilizando Gel Doc XR + con software de laboratorio de imágenes (Bio-Rad). Los amplicones positivos de PCR se enviaron al Centro Ramaciotti de Genómica (UNSW, Sydney, Australia) para la secuenciación de Sanger. Los productos de PCR se purificaron usando un kit EXOSAP-IT (Thermo Fisher Scientific) y la secuenciación se realizó con el cebador directo JDPFw (5'-GGCCCAGATCGTTTACCGTGAA-3') usando la mezcla de reacción BigDye Terminator (V3.1) en el analizador de ADN 3730 (Applied Biosystems, Massachusetts, Estados Unidos).

Las secuencias de nucleótidos de baja calidad se verificaron y recortaron manualmente con el software Chromas (2.6.6) (Technelysium Pty Ltd, Brisbane, Australia) [32]. Las lecturas de la secuencia recortada se volcaron en la base de datos de secuencias de nucleótidos del NCBI (BLASTn) para identificar los genotipos y especies de Acanthamoeba. Además, las cepas aisladas de Acanthamoeba se caracterizaron morfológicamente según la especie según el esquema de clasificación de Pussard y Pons [33]. Todas las lecturas de secuencias confirmadas y validadas se enviaron al depósito de datos de secuencias de GenBank. Las secuencias de nucleótidos disponibles públicamente de los genotipos de Acanthamoeba se recuperaron del NCBI como cepas de referencia para el análisis filogenético (Archivo adicional 1: Tabla S1). Las secuencias se alinearon utilizando el algoritmo ClustalW y se construyó un árbol filogenético utilizando el método de máxima verosimilitud y el enfoque bayesiano con parámetros Kimura-2 mediante 1000 arranques en MEGA-X [34] y el árbol filogenético se visualizó utilizando el árbol de la vida interactivo (iTOLv6) [ 35].

Acanthamoeba se cultivaron axénicamente y se mantuvieron en PYG (glucosa de levadura de peptona, pH 6,5) [36]. Todos los aislamientos se sembraron en pocillos separados de una placa de cultivo de 24 pocillos con medio PYG (500 µl/pocillo) y se incubaron estáticamente a 28 °C hasta que los trofozoítos formaron capas confluentes al 90 % en el fondo de cada pocillo. Se inocularon alícuotas de PYG en agar de soja con tripticasa (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, EE. UU.) y se incubaron a 37 °C durante 48 h. Al final de la incubación, se examinaron las placas de agar en busca de crecimiento de cualquier bacteria. Antes de recolectar los trofozoítos, el medio PYG se reemplazó suavemente por 1 ml de PBS que contenía gentamicina (100 μg/ml) para eliminar cualquier bacteria extracelular y la placa se colocó en hielo con agitación suave para desalojar los trofozoítos adheridos. Se utilizó el reactivo TRIzol (Invitrogen, Life Technologies, Nueva York, EE. UU.) para la extracción completa de gDNA siguiendo el método de separación de fenol-cloroformo según el protocolo del fabricante. El método se modificó ligeramente para excluir la adición de EDTA, que puede interferir con el ensayo de PCR al secuestrar iones Mg2+ [37]. Para mejorar la recuperación de gDNA, las suspensiones de células tratadas con TRIzol se pasaron 10 veces a través de agujas de jeringa 25G (BD, Nueva Jersey, EE. UU.) para lisar las células amebal.

El gen 16S rRNA (región V4) de bacterias intracelulares se amplificó utilizando el cebador eubacteria 16S rRNA; 515Fw/806Rv: Fw (5′- CCTACGGGNGGCWGCAG-3′) y Rv (5' – GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′) [38]. Se incluyeron ADN genómico de E. coli ATCC 10.798 y agua libre de nucleasas como controles positivo y negativo, respectivamente. La presencia de hongos intracelulares se evaluó utilizando cebadores ITS1Fw directos específicos de hongos (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') e ITS4Rv inversos (5'-CCTCCGCTTATTGATATGC-3') dirigidos a las secuencias conservadas de 18S y 28S rDNA [39]. Se incluyó un aislado clínico de Candida albicans como control y se identificó el hongo intracelular mediante secuenciación de Sanger del amplicón de PCR.

Para visualizar las bacterias u hongos intracelulares se realizó FISH en combinación con microscopía confocal siguiendo un protocolo previo [40]. Brevemente, se recogieron 1 ml de células de ameba (> 90 % de trofozoítos) cultivadas axénicamente en tubos eppendorf de 1,5 ml y se centrifugaron durante 5 min a 3000 g para cosechar los trofozoítos. El sedimento celular se lavó dos veces con solución salina de Page 1X y se transfirieron 30 µl de suspensión amebiana a portaobjetos recubiertos con poli-l-lisina (Thermo Scientific, Braunschweig, Alemania) y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Las células adherentes se fijaron aplicando 30 µl de formaldehído al 4 % recién preparado (tamponado, pH 6,9) durante 25 min. Las células amebianas adheridas se lavaron con PBS 1X, se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol (50 %, 80 % y 96 %, 3 min cada una) y se secaron al aire. Las bacterias intracelulares se examinaron mediante hibridación con la sonda EUB338 específica del dominio bacteriano marcada con Cy3 [41], y los hongos con la sonda PF2 específica del hongo conjugada con Hex y una sonda EUK516 marcada con Cy5 (Tabla 1) [42] para el ARNr 18S eucariótico (Biómeros). , Ulm, Alemania). Se mezclaron alícuotas (1 µL de 50 ng/µL) de cada sonda con 9 µL de tampón de hibridación (Tris-HCl 20 mM, pH 7,1, NaCl 900 mM y formamida al 20 % v/v, SDS al 0,01 %) y se añadieron a la solución fijada. Células amebales en portaobjetos. La hibridación se llevó a cabo durante al menos 90 min a 46 °C en la oscuridad, después de lo cual los portaobjetos se enjuagaron con 20 µL de tampón precalentado (48 °C) (NaCl 180 mM, Tris/HCl 20 mM, pH 7,2 y 0,01 % FDS). Luego, los portaobjetos se cubrieron con 200 µL de tampón y se realizó un paso de lavado a 48 °C durante 25 min. Todos los portaobjetos se sumergieron rápidamente en agua MilliQ helada, se secaron al aire y se montaron con Prolong Diamond Antifade con DAPI (Thermo Fisher Scientific); luego, los portaobjetos montados se dejaron curar durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad antes de obtener la imagen. Se realizaron tres ensayos independientes y se visualizaron al menos 30 células huésped de amebas bajo el microscopio de barrido láser confocal Olympus FV1200 en la instalación de microscopía de luz Katharina Gaus de la UNSW y las imágenes FISH se analizaron en ImageJ [43].

Las características demográficas y clínicas de los 13 pacientes con QA se recuperaron en una hoja de datos personalizada de los registros hospitalarios y se revisaron las siguientes características: agudeza visual (AV) inicial y final; síntomas informados; duración, tamaño y características de los infiltrados y defectos epiteliales (algunas medidas fueron transcritas de imágenes clínicas); tratamiento previo (definido como medicamentos utilizados antes de la primera presentación de pacientes en LVPEI); regímenes de tratamiento clínico y duración bajo atención en LVPEI; necesidad de cirugía; resultado del tratamiento; ocupación de los pacientes; y los factores de riesgo informados para la QA [45].

El análisis de datos se realizó en el software SPSS versión 26.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL). Las proporciones se presentaron como porcentaje y se calculó la media ± desviación estándar para los datos continuos. Se calculó un intervalo de confianza (IC) del 95 % para los datos demográficos y clínicos utilizando la proporción (p) ± 1,96* SEM (error estándar de la media). Se usaron la prueba exacta de Fisher y la chi cuadrada para la comparación de datos clínicos y demográficos con el estado de endosimbionte con el nivel de significación del valor de P < 0,05 para las pruebas de 2 colas.

Entre los 13 pacientes con AK, el mayor número de casos (30,8 %, 4 pacientes con AK) se observaron en febrero (archivo adicional 1: fig. S1). Los pacientes procedían de seis estados diferentes de la India; cinco eran de Telangana, tres de Maharashtra, dos de Andhra Pradesh y uno de Rajasthan, Uttar Pradesh y Tripura (Fig. 1).

Mapa que muestra los estados de los pacientes con AK y el hospital LVPEI en India. El mapa fue creado utilizando ArcGIS (Esri GIS, California, EE. UU.). AP Andhra Pradesh, MA Maharashtra, RA Rajasthan, TE Telangana, TR Tripura, UP Uttar Pradesh

La identificación de las cepas de Acanthamoeba y su crecimiento a diferentes temperaturas se muestran en la Tabla 2. Siete aislados (53,8%) crecieron a 40 °C y 42 °C, demostrando la termotolerancia de ciertas cepas que causan QA. La Figura 2 muestra los trofozoítos (1A y 1B) y los quistes (1C-1E) de un aislado de Acanthamoeba (L-2483/20). La Figura 3 muestra la imagen en gel de agarosa de los productos de PCR de la región DF3 del gen 18S rDNA amebal y el 16S rRNA bacteriano. Se confirmó que todas las amebas eran Acanthamoeba, de las cuales ocho (61,5 %, 8/13) albergaban bacterias intracelulares y un aislado (L-2429/20) contenía hongos. No crecieron bacterias a partir de las alícuotas de PYG cultivadas en agar de tripticasa de soja, lo que sugiere que era muy probable que cualquier bacteria identificada en los experimentos FISH se ubicara intracelularmente.

Estructuras de trofozoítos de Acanthamoeba (A) con acanthopodia, las flechas indican proyecciones en forma de aguja en la superficie celular. B, imagen confocal de núcleos de trofozoítos teñidos con DAPI. C, D, fases de enquistamiento de la cepa L-1326/20 desde el prequiste (C, D) hasta quistes poligonales de doble pared (E), las flechas indican quistes poligonales de Acanthamoeba. Barra de escala, 10 µm

Imagen de gel de agarosa recortada de amplicones de PCR de aislamientos de Acanthamoeba y bacterias intracelulares. Las bandas se visualizaron usando electroforesis en gel al 1%; los pares de cebadores JDPFw/Rv y 515Fw/806Rv produjeron amplicones de ~450 pb y ~293 pb, respectivamente. A. castellanii (ATCC 30868) y E. coli (ATCC 10798) se usaron como control positivo para las reacciones de PCR 18S rRNA y 16S rRNA y se usó agua libre de nucleasas como control negativo. Las imágenes de gel de tamaño completo se incluyen en el archivo adicional 1 (Figs. 4 y 5)

Árbol filogenético inferido de las secuencias de ARNr 18S de aislamientos de Acanthamoeba. El árbol se creó utilizando el enfoque de unión de vecinos con el parámetro Kimura 2 basado en 1000 valores de arranque replicados. Los aislamientos de Acanthamoeba (de color azul) de este estudio formaron dos clados genotípicos principales; T4 fue el genotipo predominante (tres subgrupos: T4A, T4B y T4F) y T12 tuvo solo un aislado, "*" indica especies y genotipos de referencia de NCBI (de color púrpura)

Imágenes representativas del ensayo FISH que representan bacterias intracelulares A y hongos C de aislamientos de Acanthamoeba. Una bacteria en forma de varilla se dispersó por todas las células de ameba en la población que se detectó usando la sonda EUB338 (L-579/20, indicada por flechas rojas). B Trofozoíto de Acanthamoeba (L-552/20) sin bacterias u hongos intracelulares. C Se observaron células fúngicas ovoides grandes dentro de la cepa Acanthamoeba usando la sonda PF2 (L-2429/20, indicada por flechas amarillas). Barra de escala, 12 µm

La secuencia de nucleótidos parcial de la región DF3 del ADNr 18S amebal se alineó utilizando el algoritmo ClustalW y mostró la mayor variación de secuencia de nucleótidos entre cepas (Archivo adicional 1: Fig. S2). El análisis filogenético de unión de vecinos de 13 aislamientos formó dos clados principales, con la mayoría de los aislamientos (12/13, 92,3%) pertenecientes al genotipo T4 (L-552/20, L-1133/20, L-1257/20, L- 2482/20, L-2483/20, L-2487/20: A. culbertsoni, L-579/20, L-1326/20: A. polyphaga, L-1137/20, L-2429/20: A. triangularis, y L-604/20, L-1765/20: Acanthamoeba spp. T4) y un aislado (L-2391/20) de genotipo T12 (A. healyi; Tabla 2 y Archivo adicional 1: Tabla S2). Junto con la morfología del quiste, se asignó a cada aislamiento la secuencia que producía la mayor alineación (% de identidad) con secuencias en NCBI de especies y genotipos existentes de Acanthamoeba. Para dos aislamientos (L-604/20 y L-1765/20), la morfología del quiste no era obvia para una especie particular de Acanthamoeba, pero el análisis filogenético y de voladura de nucleótidos del NCBI confirmó que ambas cepas pertenecían al genotipo T4. El genotipo T12 se detectó en un agricultor de Maharashtra sin antecedentes de trauma ocular; otros dos casos del mismo estado estaban infectados con el genotipo T4. Los diez aislamientos restantes de variantes T4 se recuperaron de pacientes con AK de Andhra Pradesh, Rajasthan, Telangana, Tripura y Uttar Pradesh (Archivo adicional 1: Mapa S1). En el clado T4 predominante, los aislados formaron tres subgrupos, T4A (1 aislado), T4B (10 aislados) y T4F (1 aislado). La secuencia de nucleótidos de los 13 aislamientos se ha depositado en GenBank con los números de acceso OK042094 a OK042106 (Tabla 2). Del genotipo T4B, 6 pacientes estaban infectados con A. culbertsoni, 2 con A. polyphaga y uno con A. triangularis o Acanthamoeba spp. Un paciente estaba infectado con T12 A. healyi y otro paciente (L-1765/20) estaba infectado con T4A Acanthamoeba spp. (Figura 4).

Entre los 13 aislamientos de Acanthamoeba, 9 (69,2 %) dieron positivo para microbios intracelulares con ocho bacterias que albergaban (Fig. 3) y un aislado (L-2429/20) que albergaba el hongo Malassezia restricta (Archivo adicional 1: Fig. S3). Para los ocho aislamientos que albergaban bacterias, se observaron bacterias intracelulares en forma de bastón en todo el citoplasma, y las bacterias estaban presentes en todas las células de Acanthamoeba en la población observada. No se observaron bacterias extracelulares, como se esperaba debido al protocolo. M. restricta se vio como células verdes de forma ovalada dentro del aislado de Acanthamoeba (Fig. 5).

La duración media de los síntomas de los pacientes con QA infectados por Acanthamoeba con bacterias u hongos intracelulares fue de 43,0 ± 44,3 días en comparación con los 16,5 ± 5,1 días de los pacientes infectados con Acanthamoeba libre de endosimbiontes (Tabla 3). Entre esos nueve casos de QA, seis tenían antecedentes de trauma ocular (n = 4) o uso de lentes de contacto (n = 2) y tres eran granjeros. Se observó una forma grave de QA con infiltrado estromal (88,9 %, 8/9) e hipopión (55,6 %, 5/9) en presencia de endosimbiontes ameba y cinco casos tenían tanto infiltrado estromal como hipopión. Sin embargo, estas diferencias en el infiltrado estromal (p = 0,2) y el hipopión (p = 1,0) no fueron significativamente más frecuentes en los pacientes con QA con endosimbiontes amebales en comparación con aquellos sin endosimbiontes. Curiosamente, se observó una mayor duración del tratamiento médico (mediana, IQR: 75,0, 43,5-202,5 frente a 30,0, 17,0-91,8 días) en pacientes sin endosimbiontes de Acanthamoeba (p = 0,2). En presencia de endosimbiontes, la proporción de pacientes con cicatrización de úlcera (66,6%) o mejoría de la AV final (44,4%) fue menor en comparación con aquellos sin endosimbiontes (75% y 50%, respectivamente) (p > 0,05). Dos pacientes (25%, 2/8) infectados por Acanthamoeba con endosimbiontes bacterianos habían recibido antibióticos junto con fármacos antiamebianos y las úlceras de ambos casos se resolvieron tras la medicación.

La mayoría de los pacientes con QA eran granjeros (5/13) o estudiantes (5/13) y los factores de riesgo informados asociados con QA fueron trauma ocular (4 casos; 30,8 %; IC 95 % = 9,1—61,4) y uso de lentes de contacto ( 2 casos; 15,4%; IC 95% = 1,9-45,5). Se informó QA unilateral en 12 (92,3%) casos. La mayoría de los pacientes con QA tenían una visión disminuida (84,6 %) como síntoma principal seguido de dolor ocular (69,2 %), enrojecimiento (69,2 %), lagrimeo (53,8 %) y mancha blanca en la córnea (15,4 %). Se observó un infiltrado en anillo característico de QA típico (> 4 mm) en 3 (23,1%) casos. Se observó defecto epitelial en 6 casos (46,2 %; 6,2 ± 1,7 mm), infiltrados estromales en 10 casos (76,9 %; 5,0 ± 2,2 mm) e hipopión en 6 casos (46,1 %; 1,12 ± 0,6 mm). La mediana de duración del inicio de los síntomas fue de 20 días (RIC = 15-30) y la agudeza visual final no mejoró en ≥ 2 líneas entre los pacientes con antecedentes ganaderos (5/5, 100 %), edad > 32 años (4/6 , 80 %) y pacientes que presentan síntomas de QA durante más de 20 días (3/6, 50 %) (Archivo adicional 1: Tabla S3). El PHMB y la clorhexidina fueron los tratamientos más comunes en este estudio (11 casos; 84,6%). Tres casos recibieron antibióticos, un caso antiviral y un caso antifúngico como terapia de apoyo (38,5%); para estos no hubo mejoría (p > 0,05) en la BCVA en la presentación final en comparación con los casos tratados solo con PHMB y clorhexidina. En general, la mediana de duración del tratamiento médico fue de 38 días (RIC = 23-90). De seis casos con tratamiento quirúrgico, 4 casos tuvieron queratoplastia penetrante terapéutica (TPK, n = 4), incluido un caso que tuvo un trasplante de membrana amniótica (Tabla 4). De los dos casos restantes, uno recibió terapia antimicrobiana fotodinámica con rosa de bengala (RB-PDAT) y uno se sometió a evisceración. Entre 6 pacientes que tuvieron que someterse a cirugía ocular, el 66,7% (4/6) estaban infectados por cepas de Acanthamoeba con bacterias intracelulares.

Trece aislados clínicos de Acanthamoeba spp. de Hyderabad, India, se genotipificaron y se analizaron las presentaciones clínicas asociadas con pacientes con QA. T4 fue el genotipo más común (92,3 %), como se informó a nivel mundial [45,46,47,48]. A. culbertsoni (6, 46,2%) fue la especie predominante entre el genotipo T4, y esto se informó previamente en India [45]. Un aislamiento recuperado de un paciente sin factores de riesgo preexistentes pertenecía al clado T12, que se ha aislado con poca frecuencia de casos de QA [19].

El estudio actual respalda que la queratitis predominante que causa el genotipo T4 también prevalece en varios estados (Andhra Pradesh, Maharashtra, Rajasthan, Telangana, Tripura y Uttar Pradesh) de la India. Según el conocimiento de los autores, este es solo el segundo informe del genotipo A. healyi T12 de infección corneal en la India [45]. Se informó un caso grave de QA causado por el genotipo T12 en Bangkok, Tailandia [19], donde el paciente tenía antecedentes de exposición a un químico corrosivo y había usado agua del grifo para enjuagar el ojo infectado. Entre las cepas T4 (92,3 %, 12/13), la mayoría eran T4B (83,3 %, 10/12), con un aislamiento de cada uno de T4A y T4F. Un estudio indio anterior informó 13 cepas (50 %) del subgrupo T4B de 26 aislamientos, siendo otros T4A (dos aislamientos), T4D (10 aislamientos) y T4E (un aislamiento) [45]. T4A (38%) fue el principal subgenotipo de aislamientos de Acanthamoeba recuperados de pacientes chilenos con QA, seguido por T4B, T4G, T4C y T4D [46]. Entre las cepas T4, se han informado en diferentes países otras variantes de DF3 como T4E, F, G, I, J, N, O, P, V y X asociadas con infecciones de la córnea [46, 49, 50]. Estos hallazgos implican una diferencia geográfica entre los aislamientos de T4 que causan QA, pero esto requiere más investigación.

La incidencia de QA está aumentando constantemente en todo el mundo con aproximadamente el 90% de los casos asociados con lentes de contacto en países desarrollados [49]. Aunque el uso de lentes de contacto no se asocia comúnmente con QA en India y otras naciones en desarrollo, [45, 51] el aumento global de la miopía y el uso de lentes de contacto para prevenir la miopía, con fines cosméticos y actividades deportivas han aumentado el riesgo de QA, especialmente entre los jóvenes [1]. Como se observó en el estudio actual, el traumatismo ocular y el contacto con suelo o agua contaminados son los principales factores de riesgo predisponentes de la infección por QA no relacionados con el uso de lentes de contacto [52,53,54]. La lesión ocular con partículas de polvo o materia vegetal fue el factor de riesgo informado más común entre los pacientes con QA en el centro de China (52,1 %) [55] y el sur de la India (48,7 %) [52].

La AV final no mejoró en 2 o más líneas entre agricultores (100 %), pacientes con edad > 32 años (80 %) y casos con síntomas de queratitis durante > 20 días (50 %). Un estudio del Reino Unido también informó los peores resultados clínicos para pacientes con QA mayores de 34 años [56]. La integridad de la córnea se debilita con la edad y la mayor incidencia de ojos secos entre las poblaciones de mayor edad puede ser un posible factor predisponente para la forma grave de QA [9]. Un estudio previo de queratitis bacteriana por LVPEI respalda la asociación del tamaño del defecto epitelial con la pérdida de AV encontrada en el estudio actual [57]. Las profesiones de los pacientes suelen estar relacionadas con los factores de riesgo [55]. En el estudio actual, entre cinco casos con antecedentes agrícolas, cuatro (80%) tenían antecedentes de traumatismo ocular que puede haber sido causado por materias externas no estériles, ya que los enmarcadores están frecuentemente expuestos a actividades al aire libre y tres pacientes (75%, 3/ 5) fueron infectados por cepas de Acanthamoeba con bacterias intracelulares. Los cuatro casos tuvieron que someterse a cirugía ocular, pero la agudeza visual no mejoró incluso después de la recuperación postoperatoria. El trauma ocular con objetos contaminados puede ser un vehículo ideal para la invasión de células de Acanthamoeba que conduce a una forma grave de QA. Aproximadamente el 90% de los pacientes con QA con antecedentes de lesiones oculares recibieron injertos de córnea para restaurar la visión en el sur de China [58].

Entre los 13 aislamientos de Acanthamoeba, 8 (61,5 %) poseían bacterias intracelulares y esto es muy similar al 59,4 % de Acanthamoeba que poseía bacterias intracelulares en un estudio de los EE. Colección de cultivos tipo [26] o un estudio anterior (1993) de los EE. UU. que utilizó solo técnicas de tinción tradicionales para revelar los microbios intracelulares [59]. Se han detectado bacterias intracelulares pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Legionella, Chlamydia y Mycobacterium en aislamientos de Acanthamoeba recuperados de casos de QA en los EE. UU. [25] mientras que Rickettsiales, Mycobacterium y Parachlamydia spp. se detectaron en cepas de ATCC aisladas de frotis nasal humano, córnea y sedimento de lago, respectivamente [26]. Fritsche et al. [59] han observado bacterias con forma de bastoncillos y cocos en cepas ambientales (24 %) y clínicas (26 %) de Acanthamoeba de diferentes lugares. Se ha observado la coexistencia de microbios intracelulares filogenéticamente diversos dentro de una célula de Acanthamoeba [60]; Aspergillus spp., P. aeruginosa y HAdV (adenovirus humano) se detectaron en un aislado clínico de Acanthamoeba en Irán [61]. Hasta donde sabemos, este es el primer informe que describe a M. restricta como un endosimbionte de Acanthamoeba. El paciente era un agricultor con antecedentes de trauma ocular con un agente químico y la úlcera corneal no se resolvió con tratamiento médico con PHMB y clorhexidina durante un mes. La coinfección por Acanthamoeba y Malassezia no se ha descrito en pacientes con QA, pero M. restricta ha causado con poca frecuencia queratitis fúngica [62]. Otros estudios han informado queratitis debido a la coinfección de Acanthamoeba con hongos como Cladosporium, Fusarium y Curvularia [23, 63, 64].

Las bacterias intracelulares de Acanthamoeba pueden aumentar el daño epitelial de la córnea, como se ha demostrado en un estudio clínico y un modelo celular [25]. Aunque en el presente estudio no hubo diferencias significativas en las manifestaciones clínicas, la presencia de endosimbiontes bacterianos se asoció con una mayor proporción de infiltrados estromales (87,5 %), defectos epiteliales (62,5 %) e hipopión (50 %). Según los datos actuales, para mostrar el efecto significativo de estas diferencias, un mínimo de 54 sujetos (prueba z para la diferencia entre dos proporciones independientes; error α = 0,05, error 1-β = 0,8, puntuación z = 1,95 y relación de asignación = 1:1) se requiere en estudios futuros (G*Power v3.1.9.7).

En el estudio actual, dos casos (25%, 2/8) afectados por Acanthamoeba con endosimbiontes bacterianos habían recibido antibióticos (ciprofloxacina y doxiciclina) junto con fármacos antiamebianos tópicos y la úlcera de ambos casos se resolvió después del tratamiento. Los casos restantes de QA con bacterias intracelulares curaron cuando se trataron solo con PHMB y clorhexidina. Esto es de esperar ya que estos antisépticos también son efectivos contra las bacterias [65]. La adición de antibióticos puede ser ventajosa para la quimioterapia antiamebiana para anular los rasgos que aumentan la virulencia de las bacterias intracelulares [26]. Por otro lado, la liberación de endosimbiontes después de la muerte del huésped amebal en una córnea comprometida puede aumentar la inflamación y empeorar los resultados clínicos. En la actualidad, no se comprende completamente si los remedios auxiliares para el tratamiento antiamebiano, como los antibióticos, son efectivos en comparación con los medicamentos antiamebianos solos [66] y el papel de los endosimbiontes durante las infecciones amebianas aún no se ha explorado completamente [25]. El tamaño de la muestra del estudio actual puede ser inadecuado para medir diferencias clínicamente significativas entre estos dos grupos. Sin embargo, como estudio de referencia con datos piloto, este estudio es valioso para fines epidemiológicos y taxonómicos de la queratitis por Acanthamoeba. Se necesitan estudios futuros para examinar el impacto de los endosimbiontes amebianos en la patogenicidad del huésped, la susceptibilidad al fármaco, el resultado clínico y los beneficios de agregar adyuvantes antibacterianos a la quimioterapia antiamebiana estándar con una cohorte más alta y un seguimiento prolongado de pacientes con QA.

Este estudio confirma que los aislamientos de Acanthamoeba que causan queratitis eran principalmente del genotipo T4 seguido del T12, con tres variantes subgenómicas T4A, T4B y T4F identificadas dentro del genotipo T4 predominante. No hubo una asociación significativa entre las especies y/o genotipos de Acanthamoeba y el resultado clínico de un paciente. En el estudio actual, se observó una gran cantidad de cepas de Acanthamoeba con endosimbiontes y, aunque no hubo una relación clara con el resultado clínico, los endosimbiontes de Acanthamoeba pueden estar involucrados en la configuración de la virulencia, la supervivencia y la susceptibilidad a los fármacos del huésped amebal.

Los datos clínicos de los pacientes con QA están disponibles en hojas de Excel y SPSS que se pueden obtener del autor correspondiente a pedido razonable. El número de acceso de GenBank asignado de la secuencia de nucleótidos osciló entre OK042094 y OK042106 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucore/?term=OK042094:OK042106[accn]).

Queratitis por Acanthamoeba

Amplímero específico de Acanthamoeba

Agudeza visual mejor corregida

Trifosfato de desoxinucleósido

Fragmento diagnóstico 3

Instituto de ojos LV Prasad

Biguanida de polihexametileno

Gen del ARN ribosomal 18S de la subunidad pequeña nuclear

Agar sin nutrientes

Hibridación in situ fluorescente

Reacción en cadena de la polimerasa

Terapia antimicrobiana fotodinámica con rosa de bengala

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Agradecemos la contribución de LVPEI, Hyderabad, India, por proporcionar cepas de Acanthamoeba y datos clínicos de pacientes con QA. BR es beneficiario de la beca Tuition Fee Scholarship (UNSW, Sydney) para su doctorado, con el cual completó este estudio.

El resumen preliminar de este estudio se presentó en el Foro Mundial de Microbios, del 20 al 24 de junio de 2021 (virtual) y en la Reunión Científica Anual de la Sociedad Australiana de Microbiología, del 31 de mayo al 3 de junio de 2021 (virtual), como presentación de póster.

No se proporcionó financiación para este estudio.

Escuela de Optometría y Ciencias de la Visión, Facultad de Medicina y Salud, UNSW, Sydney, Australia

Binod Rayamajhee, Mark Willcox, Gauri Shankar Shrestha y Nicole Carnt

Centro de Microbiología Jhaveri, Centro de Investigación Ocular Prof. Brien Holden, Fundación de Investigación Ocular de Hyderabad, Instituto Ocular LV Prasad (LVPEI), Campus Kallam Anji Reddy, Hyderabad, India

savitri sharma

Instituto de Investigación Biomédica y de Salud Ambiental, Facultad de Ciencias de la Salud y la Vida, Universidad del Oeste de Escocia (UWS), Paisley, PA1 2BE, Escocia, Reino Unido

Fiona L. Henríquez

El Instituto de Córnea, LV Prasad Eye Institute, Banjara Hills, Hyderabad, India

Raksheeth Nathan Rajagopal y Bhupesh Bagga

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Monash, Clayton, VIC, 3800, Australia

Dinesh Subedi

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El manuscrito fue escrito a través de contribuciones de todos los autores; conceptualización y diseño del estudio: NC, MW, FLH, BR, SS; Colección de cepas de Acanthamoeba: SS; extracción de datos clínicos: SS, RN, BB; análisis de datos clínicos: GS, BR; investigación de laboratorio y análisis de datos: BR, DS, MW, FLH, NC; redacción: borrador original preparación: BR; y revisión y edición: MW, NC, FLH, GS, DS, SS, RNR; supervisión: NC, MW, FLH y SS. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Binod Rayamajhee.

Este protocolo de estudio fue revisado y aprobado por la junta de revisión institucional de LVPEI, Hyderabad (LEC-BHR-R-09–21-758). Se obtuvo el consentimiento por escrito bien informado de todos los participantes. Este estudio se realizó de acuerdo con los principios éticos y las pautas descritas en la Declaración de Helsinki.

No aplica.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Cepas de Acanthamoeba de referencia utilizadas en este estudio para el análisis filogenético. Tabla 2: Identificación de genotipos y especies de aislamientos de Acanthamoeba recuperados de pacientes con QA. Mapa 1: Mapa que muestra los estados de los pacientes con AK de diferentes estados de India con códigos de muestra y genotipos identificados de Acanthamoeba de pacientes con AK. El mapa fue creado utilizando ArcGIS (Esri GIS, California, EE. UU.). Figura S1. Distribución mensual de casos de QA durante el periodo de estudio. Figura S2. Alineación de secuencias de la región DF3 del ADNr 18S de Acanthamoeba usando ClustalW. Tabla S3. Presentación clínica general de los pacientes con queratitis infectados con Acanthamoeba spp. Figura S3. Árbol filogenético inferido de la secuencia de ADNr 18S (ITS1) de hongos; El árbol se creó utilizando el enfoque de unión de vecinos con el parámetro Kimura 2 basado en 1000 réplicas de valores de arranque. Figura S4. Imagen de gel de agarosa (1 %) de amplicones de PCR de 13 aislados de Acanthamoeba (ARNr 18S), el ensayo de PCR se realizó utilizando un par de cebadores específicos del género Acanthamoeba JDPFw y JDPRv que produjeron ~450 pb de amplicones. Fig. S5: Imagen de gel de agarosa (1 %) de amplicones de PCR de 13 aislados de Acanthamoeba dirigidos a bacterias intracelulares Se utilizó el par de cebadores 16S rRNA, 515Fw y 806Rv (V4, 16S rRNA), que produjo ~293 pb de amplicones.

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Reimpresiones y permisos

Rayamajhee, B., Sharma, S., Willcox, M. et al. Evaluación de genotipos, endosimbiontes y características clínicas de Acanthamoeba recuperados de infección ocular. BMC Infect Dis 22, 757 (2022). https://doi.org/10.1186/s12879-022-07741-4

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Recibido: 05 Mayo 2022

Aceptado: 12 de septiembre de 2022

Publicado: 29 de septiembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12879-022-07741-4

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