Efecto antiviral del cloruro de cetilpiridinio en enjuague bucal sobre el SARS

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 14050 (2022) Citar este artículo

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El cloruro de cetilpiridinio (CPC), un compuesto de amonio cuaternario, presente en los enjuagues bucales, es efectivo contra bacterias, hongos y virus envueltos. Este estudio se realizó para explorar el efecto antiviral de CPC en SARS-CoV-2. Hay pocos informes sobre el efecto de la CPC contra el SARS-CoV-2 de tipo salvaje en concentraciones bajas, como 0,001 %–0,005 % (10–50 µg/mL). Curiosamente, encontramos que las bajas concentraciones de CPC suprimieron la infectividad de las cepas humanas aisladas de SARS-CoV-2 (Wuhan, Alpha, Beta y Gamma) incluso en la saliva. Además, demostramos que CPC muestra efectos anti-SARS-CoV-2 sin alterar la envoltura del virus, utilizando análisis de densidad de sacarosa y examen con microscopio electrónico. En conclusión, este estudio proporcionó evidencia experimental de que el CPC puede inhibir la infección por SARS-CoV-2 incluso en concentraciones más bajas.

Según la información reciente del centro de recursos de coronavirus, Universidad de Medicina Johns Hopkins1, COVID-19 es responsable de más de 420 millones de casos y alrededor de 6 millones de muertes en todo el mundo.

El SARS-CoV-2 se informó originalmente en Wuhan, China2 y también se informaron algunas variantes de interés y variantes de preocupación (COV)3. Además, le preocupa que algunas variantes como Delta y Omicron puedan tener la capacidad de evadir la inmunidad inducida por la vacuna4,5,6. Por lo tanto, a los científicos les preocupa que la pandemia de SARS-CoV-2 pueda continuar incluso después del aumento de la cobertura de vacunación.

Se ha informado que el SARS-CoV-2 infecta las células epiteliales de la mucosa oral y las glándulas salivales, que expresan factores de entrada virales, la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y los miembros de la proteasa transmembrana serina (TMPRSS)7. Por lo tanto, de esta manera, la cavidad oral juega un papel crucial en la infección y transmisión del SARS-CoV-2. Aunque el síntoma de la COVID-19 relacionado con la cavidad bucal es la disgeusia y la estomatitis8,9, muchas personas infectadas por el SARS-CoV-2 podrían estar asintomáticas, lo que provocaría su transmisión a otras personas.

El SARS-CoV-2 puede replicarse en la cavidad oral y liberarse en la saliva7. Además, el SARS-CoV-2 puede replicarse en el epitelio respiratorio10 y puede transmitirse a la cavidad oral al toser. La transmisión del SARS-CoV-2 a través de gotitas y/o aerosoles provoca su infección y replicación en las células epiteliales alveolares pulmonares, lo que resulta en daño alveolar11. Además, se informa que la transmisión del SARS-CoV-2 ocurre a través de gotitas de actividades espiratorias, como hablar, toser y estornudar12,13. Curiosamente, las personas infectadas por SARS-CoV-2 pueden convertirse en una fuente de transmisión incluso durante el período de incubación asintomático del virus14. Por lo tanto, necesitamos investigar la estrategia de profilaxis contra COVID-19. Además, se ha informado la relación entre la aspiración de gotitas de saliva que contienen SARS-CoV-2 y el agravamiento de COVID-1915. Por lo tanto, el cuidado bucal es importante para la prevención de la transmisión del SARS-CoV-2.

El enjuague bucal se ha centrado en prevenir la infección del microbioma16. Además, recientemente se ha informado que varios componentes del enjuague bucal reducen los viriones del SARS-CoV-2 en la cavidad bucal17,18. El cloruro de cetilpiridinio (CPC) se usa ampliamente como uno de los componentes bactericidas de enjuagues bucales, tabletas, aerosoles y gotas. El CPC puede alterar la membrana lipídica a través de interacciones fisicoquímicas. Ya se ha informado que el CPC tiene efectos bactericidas y antivirales contra el virus de la influenza19 y los coronavirus20,21,22. En comparación con otros ingredientes de los enjuagues bucales, como la povidona yodada y la clorhexidina (CHX); CPC es insípido, inodoro y, por lo tanto, adecuado para aplicaciones en productos para el cuidado bucal. Hasta la fecha, hay pocos informes que describan la actividad virucida de CPC contra el SARS-CoV-2. Seneviratne et al. informó que CPC redujo la carga viral de SARS-CoV-2 en la saliva de cuatro pacientes con COVID-1923 en comparación con el agua de control, pero no se describió la infectividad viral en la saliva. Un informe reciente mostró el efecto de CPC a una concentración mucho más baja que la de CPC en enjuagues bucales disponibles comercialmente contra pseudovirus24. Pero no hay ningún informe sobre el efecto del CPC en concentraciones bajas, como 0,001 %–0,005 % (10–50 µg/mL) contra el SARS-CoV-2 de tipo salvaje en la saliva. En Japón, la concentración de CPC en los enjuagues bucales disponibles comercialmente es de casi 30–50 µg/mL, que es mucho menor que en los enjuagues bucales utilizados en los informes anteriores24,25. Por lo tanto, examinamos los efectos antivirales de CPC en SARS-CoV-2 en concentraciones bajas. Además, también examinamos el mecanismo de la actividad anti-SARS-CoV-2 de CPC mediante análisis de densidad de sacarosa y observación microscópica electrónica.

Hemos examinado las cepas de SARS-CoV-2, incluidas Wuhan, Alpha, Beta y Gamma, que pertenecen a VOC. El ensayo de placas demostró que el CPC suprimió significativamente la infectividad de todos los SARS-CoV-2 examinados directamente de una manera dependiente de la dosis (Figs. 1a-d, S1). El tratamiento con CPC (50 μg/mL) inactivó por completo la cepa Wuhan del SARS-CoV-2 de manera similar a Triton X-100 (1 %) (Fig. 1e). Un enjuague bucal comercial (gárgaras médicas SP-T: SP-T) que contenía la misma concentración de CPC mostró un mejor efecto antiviral que la solución de CPC sin ingredientes que interfirieran. El título del virus del SARS-CoV-2 tratado con SP-T estuvo por debajo del límite de detección de 2,0 × 103 PFU/mL (Fig. S2). Estos resultados indicaron que las concentraciones más bajas de CPC (10–40 μg/mL) que las de los enjuagues bucales disponibles comercialmente (50 μg/mL) exhibieron efectos anti-SARS-CoV-2 en muchas cepas, incluido VOC.

Eficacia antiviral de CPC contra el SARS-CoV-2 mediante ensayo en placa utilizando células Vero E6 que expresan el gen TMPRSS2 (VeroE6/TMPRSS2). Se contaron los títulos de virus y el título de virus de las cepas SARS-CoV-2 Wuhan (a), Alpha (b), Beta (c) y Gamma (d) tratadas con CPC (0–40 μg/mL) a temperatura ambiente durante 30 min se cuantificaron y representaron como UFP/mL. El ensayo de placa también se realizó en presencia de PBS, CPC (50 μg/mL) o Triton X-100 (1%) durante 10 min. Posteriormente, las muestras se filtraron mediante columnas PD-10 para eliminar los reactivos (e). El análisis estadístico se realizó utilizando un análisis de varianza de una vía. (*p < 0,05).

A continuación, evaluamos el efecto de CPC en la entrada celular de SARS-CoV-2. Las células VeroE6/TMPRSS2 se infectaron con la cepa Wuhan de SARS-CoV-2 tratada con CPC con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01. El nivel de expresión de ARN viral en las células se redujo significativamente por CPC de manera dependiente de la dosis a las 24 h después de la infección (Fig. 2). El número de copias de ARN viral se redujo a alrededor de un trigésimo por CPC a la concentración de 15 μg/mL en comparación con el control. Estos datos indicaron que las cantidades de viriones infecciosos se redujeron por CPC antes de la entrada en la célula. Todos los experimentos se realizaron utilizando CPC a la concentración que no causó citotoxicidad (Fig. S3).

Eficacia antiviral de CPC contra SARS-CoV-2 por qRT-PCR. Se inocularon células VeroE6/TMPRSS2 con la cepa SARS-CoV-2 Wuhan a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 después de mezclar cantidades iguales de CPC. A las 24 h después de la infección, los niveles relativos de ARN de proteína N viral se evaluaron cuantitativamente mediante qRT-PCR. (*p < 0,05).

Para determinar si el CPC es efectivo en el SARS-CoV-2 en la saliva que contiene muchas proteínas y es altamente viscoso, medimos la infectividad de la cepa Wuhan del SARS-CoV-2 mediante un ensayo de placa después de la incubación con CPC en la saliva recolectada de voluntarios sanos. El ensayo de placa demostró el efecto inhibitorio de la CPC (25–40 μg/mL) contra el SARS-CoV-2 en la saliva de manera significativa y dependiente de la dosis (Fig. 3).

Eficacia antiviral de CPC frente al SARS-CoV-2 con saliva mediante ensayo en placa utilizando células Vero E6 que expresan el gen TMPRSS2 (VeroE6/TMPRSS2). Se agregó la cepa SARS-CoV-2 Wuhan en la saliva y se mezcló con la misma cantidad de CPC. (*p < 0,05).

Para analizar el mecanismo de CPC en la infectividad del SARS-CoV-2, realizamos un análisis de densidad de sacarosa de los viriones de SARS-CoV-2 tratados con 1 × solución salina tamponada con fosfato (PBS), CPC (50 μg/mL) o Triton X- 100 (1%) durante 10 min a temperatura ambiente (Fig. 4a). La proteína SARS-CoV-2 S y N mostró una distribución específica en todo el gradiente. El cambio de banda se observó en los viriones tratados con Triton X-100; sin embargo, las fracciones eran diferentes a las tratadas con PBS o CPC. En otras palabras, PBS y CPC podrían no tener efecto en la estructura de los viriones SARS-CoV-2, mientras que Triton X-100 cambió la estructura. Además, la morfología de los viriones se analizó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). El análisis microscópico electrónico reveló que la estructura de partículas esféricas del SARS-CoV-2 tratado con PBS permaneció sin cambios. También encontramos que la mayoría de las partículas de virus tratadas con 10 µg/mL de CPC permanecieron sin cambios, mientras que algunas se desintegraron con 50 µg/mL de CPC. Por el contrario, casi todas las partículas de virus tratadas con 250 µg/ml de CPC estaban claramente alteradas (como Triton X-100 al 1 %). La cantidad de 50 µg/mL se consideró una concentración en la que todas las partículas de virus no se rompieron. Este resultado es consistente con los datos del análisis de densidad de sacarosa (Fig. 4b).

Análisis de densidad de sacarosa y análisis TEM de partículas de SARS-CoV-2. ( a ) Análisis de densidad de sacarosa del ensamblaje de la cápside en presencia de 1 × PBS, CPC (50 μg / mL) y Triton X-100 (1%). La cepa SARS-CoV-2 Wuhan se trató con los regentes descritos durante 10 minutos y los viriones tratados se aplicaron a la ultracentrifugación en gradiente de densidad. Cada fracción se aplicó a SDS-PAGE y se analizó mediante transferencia Western con anticuerpos contra la proteína S y la proteína N. ( b ) Micrografías electrónicas de viriones SARS-CoV-2 después del tratamiento con reactivos. La cepa SARS-CoV-2 Wuhan se trató con 1 × PBS, CPC (10, 50, 250 μg/ml) y Triton X-100 (1 %) durante 10 min a temperatura ambiente. Cada barra de escala representa 50 nm.

En esta investigación, demostramos que el CPC en una concentración baja de 50 μg/ml o menos suprime la infectividad de la cepa Wuhan del SARS-CoV-2 y los VOC, incluidas las cepas alfa, beta y gamma. CPC mostró efectos virucidas contra el SARS-CoV-2 incluso en la saliva. Por lo tanto, encontramos que bajas concentraciones de CPC ejercían suficiente actividad antiviral contra el SARS-CoV-2. Debido a que el CPC altera las bicapas lipídicas, las altas concentraciones de CPC pueden ejercer efectos citotóxicos. Por lo tanto, el CPC se puede aplicar en una formulación que puede ejercer su efecto durante mucho tiempo a bajas concentraciones. Debido a que la formulación del enjuague bucal prototipo puede contener otros ingredientes que interfieren para calmar los bajos niveles de CPC utilizados en los experimentos, probamos un enjuague bucal comercial con la misma concentración de CPC, que mostró el mismo o mejor efecto antiviral que la solución de CPC sin ingredientes que interfieren ( Figura S2). Además, podríamos sugerir que el efecto antiviral puede no deberse a la destrucción de la membrana lipídica sino a la desnaturalización de la proteína SARS-CoV-2.

Se ha informado que el CPC es eficaz contra la variante alfa del SARS-CoV-224. Nuestro estudio reveló que el CPC atenúa la infectividad de dos variantes más (cepas Beta y Gamma) a bajas concentraciones. El tratamiento con CPC durante 1 h no mostró citotoxicidad para VeroE6/TMPRSS2 hasta 40 μg/mL (Fig. S3). Además, en estudios previos se utilizó colutorio con mayor concentración de CPC (500-750 μg/mL)24,25. A estas concentraciones, se considera que la membrana lipídica de las células podría dañarse.

La duración del efecto antiviral del enjuague bucal que contiene CPC aún no está clara; sin embargo, nuestros resultados sugieren que una concentración más baja es suficiente para mostrar un efecto antiviral. Como limitación de este experimento, cuando se aplica CPC como enjuague bucal, se supone que la duración de la acción es de un minuto. Sin embargo, considerando la complejidad de la técnica experimental y la posibilidad de errores en la duración de la acción entre las muestras, la duración mínima de la acción se fijó en 10 min en nuestro estudio. En este sentido, Anderson et al. han aclarado el efecto de CPC en un tiempo de acción de 30 s usando un método para neutralizar CPC26. Por lo tanto, está justificado desarrollar nuevos productos, como tabletas, gotas y parches que puedan liberar CPC en una concentración segura y que puedan retenerse en la cavidad oral durante el mayor tiempo posible.

Mostramos que el CPC suprimió la infectividad del SARS-CoV-2 en la saliva viscosa, que contiene varias proteínas. Sin embargo, parece que el efecto se debilita en saliva en comparación con PBS. Esto puede deberse a la presencia de proteínas de saliva cargadas negativamente, disminución de la eficiencia de difusión debido a la viscosidad y formación de micelas27. Sin embargo, incluso las concentraciones bajas de CPC mostraron una supresión suficiente de la infectividad del SARS-CoV-2. Quedan por dilucidar los efectos supresores de bajas concentraciones de CPC sobre la infectividad del SARS-CoV-2 en la saliva de pacientes reales con COVID-19.

Se cree que el mecanismo de acción que suprime la infectividad del SARS-CoV-2 se debe a la destrucción de la envoltura viral. Este estudio mostró que el CPC inactiva el SARS-CoV-2 sin interrumpir la partícula viral a la concentración y duración de los experimentos. Se ha informado que la alta concentración (250–500 μg/mL) de CPC altera la envoltura del SARS-CoV-222,28. Por lo tanto, el grado de descomposición morfológica dependiente de la concentración de CPC varía. En otras palabras, las partículas se arrugan, pero no se rompen, en una concentración que todavía es suficiente para desactivar el virus. Estos resultados son consistentes con los resultados del análisis de gradiente de densidad de sacarosa. Además, por las razones anteriores, el mecanismo antiviral de la CPC mostrado por nuestro estudio respalda el hallazgo de que la CPC interfiere principalmente con la membrana lipídica29. La Figura 4b muestra partículas de virus de varios tamaños. En informes anteriores, el diámetro del SARS-CoV-2 varió de aproximadamente 60 a 140 nm, lo que es consistente con los resultados actuales2,5,30. Sin embargo, el mecanismo detallado de inactivación del SARS-CoV-2 por una concentración más baja de CPC aún no está claro. Nuestros resultados sugieren que el efecto desnaturalizante de la proteína S puede estar involucrado en la entrada y parece jugar un papel crucial.

Se piensa que la entrada de los virus al organismo es a través de una cavidad oral y una cavidad nasal31. Al aplicar aerosoles nasales que contienen CPC y reducir la cantidad de virus en la cavidad nasal, puede conducir al control de la infección por COVID-19. Sin embargo, hasta la fecha, no hay ningún informe que muestre el uso de aerosoles nasales de CPC y aún se desconoce el efecto preventivo de los mismos.

Actualmente, estamos realizando un estudio clínico para examinar el efecto de la CPC en pacientes con COVID-19, que aborda el efecto de la CPC en la carga viral del SARS-CoV-2 en la saliva de los pacientes. Una carga viral baja en la saliva puede resultar en una baja tasa de transmisión y una menor progresión del estado de la enfermedad.

El uso de productos que contienen CPC puede conducir a una reducción en el número de pacientes con covid recién infectados. Además, puede ser un medio de medidas preventivas en países pobremente vacunados. Anticipamos que el CPC se utilizará como una de las herramientas para prevenir la aparición y la infección del SARS-CoV-2.

Las células Vero E6 (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % (v/v) y se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2. También se utilizaron para este estudio células Vero E6 que expresan establemente TMPRSS2 humano (VeroE6/TMPRSS2)32.

El Dr. Saijo (National Instituto de Enfermedades Infecciosas, Tokio, Japón). Estos virus se prepararon usando células VeroE6/TMPRSS2. Todos los experimentos con SARS-CoV-2 se realizaron en las instalaciones de Bioseguridad Nivel-3 (BSL-3) del Instituto Internacional para el Control de Zoonosis (número aprobado: 19(19), #21002-3), Universidad de Hokkaido y siguieron el estándar procedimientos operativos de BSL-3. Además, todos los diseños experimentales que utilizan patógenos fueron aprobados por la escuela de posgrado de medicina dental de la Universidad de Hokkaido (número de aprobación: R-2-4-1).

Se disolvió CPC (TCI, Tokio, Japón) con agua destilada desionizada (DDW) y se esterilizó mediante un filtro (0,45 µm de diámetro), (Sartorius, Göttingen, Alemania). Además, Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), un tensioactivo, se utilizó como control positivo. Se usó PBS como control negativo.

Se proporcionó saliva de cinco voluntarios sanos no vacunados. Se determinó que todas las muestras de saliva eran negativas para el SARS-CoV-2 mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) antes de los experimentos y se mezclaron en un tubo. Este experimento fue aprobado por el Comité de Ética Institucional de la Universidad de Hokkaido para utilizar materiales derivados de humanos. Se obtuvo el consentimiento informado de cada voluntario antes de recolectar saliva (número aprobado: 2021-2).

La viabilidad celular de VeroE6/TMPRSS2 se midió mediante un ensayo MTS [3-(4,5-dimetiltiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio] usando CellTiter 96 AQueous One Solution (Promega, Madison, WI, EE. UU.) en presencia de diferentes concentraciones de CPC (0–50 µg/ml) durante 1 h a 37 °C. La absorbancia se midió con un lector de placas/luminómetro GloMax Multiplus (Promega). Se realizaron tres experimentos independientes por triplicado.

Las cepas de SARS-CoV-2 se mezclaron con una cantidad igual de solución de CPC (concentración final: 0–50 µg/mL con DMEM que contenía FBS al 2 %) o gárgaras médicas SP-T (Lion Corporation, Tokio, Japón), que se diluyó en PBS a una concentración de 50 µg/mL, similar a CPC. La mezcla se incubó durante 30 min a temperatura ambiente y se diluyó a 1/10 con FBS DMEM al 2 % para reducir el CPC en la mezcla. La mezcla diluida se inoculó en células VeroE6/TMPRSS2 y se incubó a 37 °C durante 1 h con rotación. Después de la incubación, las células se lavaron con 1 × PBS dos veces para eliminar el CPC y luego se cubrieron con FBS DMEM al 2 % que contenía Bacto Agar al 1,2 % (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.). Después de 48 h de incubación a 37 °C, las células se fijaron con formaldehído tamponado al 3,7 % durante la noche. Las células fijadas se tiñeron con cristal violeta al 1%. Las células infectadas con SARS-CoV-2 demostraron efectos citopáticos y los grupos de células infectadas pueden verse como áreas sin teñir, como placas.

Se sembraron células VeroE6/TMPRSS2 en placas de 24 pocillos a una densidad de 1,0 × 105 células/pocillo. La cepa SARS-CoV-2 Wuhan se mezcló con la misma cantidad de CPC (concentración final: 0–25 μg/mL). En cada concentración de fármaco, los pocillos se infectaron con 1,0 × 103 PFU (MOI = 0,01) de virus. Las mezclas se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Después de la incubación, las mezclas se inocularon en células VeroE6/TMPRSS2 y se incubaron a 37 °C durante 1 h con rotación. Después de 1 h de absorción, las células se lavaron dos veces con 1 × PBS para eliminar el CPC y se cultivaron en medio de mantenimiento. A las 24 h posteriores a la infección (hpi), se extrajeron los ARN totales de las células inoculadas con el reactivo TRIzol™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se extrajo el ARN total con el kit RNeasy Mini (QIAGEN, Hilden, Alemania). Los ARN extraídos se sometieron a análisis qRT-PCR con el kit THUNDERBIRD Probe One-step qRT-PCR (TOYOBO, Osaka, Japón). El genoma del SARS-CoV-2 se cuantificó utilizando conjuntos de sondas cebadoras para N2 (Takara, Shiga, Japón). Se empleó β-actina de primate no humano como control endógeno. Las secuencias del cebador y la sonda para la β-actina de primate no humano se describieron previamente33. Los niveles del gen N del SARS-CoV-2 se normalizaron con los del ARNm de β-actina34. Además, los niveles de ARN viral a las 24 hpi se normalizaron con los niveles de ARN viral a las 0 hpi. Todas las pruebas de RT-PCR se realizaron con el sistema de PCR en tiempo real CFX96 (BioRad, Hercules, CA, EE. UU.). Se realizaron tres experimentos independientes por triplicado.

Se agregó la cepa SARS-CoV-2 Wuhan en la saliva recolectada de un voluntario sano y se mezcló con la misma cantidad de CPC (concentración final: 0–40 μg/mL). Las mezclas de saliva se diluyeron a 1/100 para reducir la viscosidad y se filtraron a través de filtros de 0,45 μm (Sartorius) para eliminar bacterias y hongos. El ensayo de placa se realizó como se describió anteriormente (Sección "Ensayo de placa"). Se realizaron tres experimentos independientes por triplicado.

La cepa SARS-CoV-2 Wuhan se trató con CPC (50 μg/mL) o Triton X-100 (1%) a temperatura ambiente durante 10 min. Después de la incubación, las mezclas se cargaron sobre gradientes de densidad de sacarosa del 10 % al 50 %. Después de la ultracentrifugación con Optima XE-90 (Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.) durante 6 h a 250 000 × g, cada 100 μL de gradientes se fraccionó en 22 fracciones y se mezcló con 100 μL de tampón de muestra SDS-PAGE y se hirvió a 95ºC. ºC durante 5 min. Después de hervir, se analizaron mediante SDS-PAGE al 10 %, seguido de un análisis de inmunotransferencia con proteína S monoclonal anti-SARS-CoV-2 de ratón (GTX632604) o proteína N policlonal de conejo (GTX135357) (GeneTex, Irvine, CA, EE. UU.). Las membranas se cortaron a 100 kDa después de la transferencia y se hibridaron con anticuerpo de proteína S y con anticuerpo de proteína N respectivamente y se sometieron a visualización. Se utilizó un ImageQuant LAS 4000 mini (FUJIFILM Corporation, Tokio, Japón) para obtener imágenes (Fig. S4).

La cepa SARS-CoV-2 Wuhan se trató con 1 × PBS, CPC (10, 50 y 250 μg/ml) y Triton X-100 (1 %) durante 10 min a temperatura ambiente. Las mezclas se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % a 4 °C durante 24 h. La muestra fijada (5 μL) se colocó en una hoja de Parafilm. Se colocó Film Formvar (#10-1009, Okenshoji, Tokio, Japón) en cada gota para adsorber el virus durante 5 min. Las rejillas se lavaron con DDW y se colocaron en una gota de solución de acetato de uranilo al 2,0 % filtrada durante 1 min más, se secaron al aire y se examinaron con un JEM-1400 TEM (JEOL, Tokio, Japón) a 80 kV.

Los análisis estadísticos se realizaron con Graphpad Prism v9 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Los datos se presentan como valores medios ± SD de triplicados biológicos. El análisis estadístico se realizó utilizando un análisis de varianza de una vía. Para todos los conjuntos de datos, se consideró significativo un valor de p inferior a 0,05.

El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética Institucional de la Universidad de Hokkaido (número de aprobación: 2021–2).

Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados en el estudio.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Los autores desean agradecer a Enago (www.enago.jp) por la revisión en inglés. Este trabajo fue apoyado por JST SPRING, número de concesión JPMJSP2119. Agradecemos a los voluntarios que donaron saliva con el consentimiento de los participantes. Agradecemos a todos los miembros del Instituto Internacional para la Investigación de Zoonosis por sus útiles comentarios y sugerencias.

Biología Vascular y Patología Molecular, Facultad de Medicina Dental y Escuela de Graduados de Medicina Dental, Universidad de Hokkaido, Sapporo, Japón

Ryo Takeda, Nako Maishi, Takuya Tsumita y Kyoko Hida

Diagnóstico y Medicina Oral, Facultad de Medicina Dental y Escuela de Graduados de Medicina Dental, Universidad de Hokkaido, Sapporo, Japón

Ryo Takeda y Yoshimasa Kitagawa

División de Patobiología Molecular, Instituto Internacional para el Control de Zoonosis, Universidad de Hokkaido, Sapporo, Japón

Hirofumi Sawa, Michihito Sasaki y Yasuko Orba

Unidad de Colaboración Internacional, Instituto Internacional para el Control de Zoonosis, Universidad de Hokkaido, Sapporo, Japón

Hirofumi Sawa y Yasuko Orba

One Health Research Center, Universidad de Hokkaido, Sapporo, Japón

Hirofumi Sawa

Sección de Apoyo a la Educación y la Investigación, Escuela de Graduados en Medicina Dental, Universidad de Hokkaido, Sapporo, Japón

Natsumi Ushijima

Servicio Comunitario y Red de Bienestar, Hospital Universitario de Hokkaido, Sapporo, Japón

Yasuhiro Hida

Odontología Restauradora, Facultad de Medicina Dental y Escuela de Graduados de Medicina Dental, Universidad de Hokkaido, Sapporo, Japón

Hidehiko Sano

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Conceptualización, KH, HS, YK y HS; metodología, MS y HS; Análisis Formal, Investigación, Curación y Visualización de Datos, RT, MS y NU; Interpretación de datos, NM y TT; Escritura—Preparación del borrador original, RT; Redacción: revisión y edición, HS, YO, YH y KH; Supervisión, HS y KH; Administración de Proyectos, HS y KH; Financiamiento Adquisición, RT y KH Todos los autores han leído y aceptado la versión enviada del manuscrito.

Correspondencia a Kyoko Hida.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Takeda, R., Sawa, H., Sasaki, M. et al. Efecto antiviral del cloruro de cetilpiridinio en el enjuague bucal sobre el SARS-CoV-2. Informe científico 12, 14050 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18367-6

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Recibido: 18 de marzo de 2022

Aceptado: 10 de agosto de 2022

Publicado: 18 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18367-6

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