Una proteasa de serina citotóxica putativa de Salmonella typhimurium UcB5 recuperada de una hamburguesa poco cocinada

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 3926 (2023) Citar este artículo

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Una exoproteasa de supuesta virulencia designada como UcB5 se purificó con éxito de la bacteria Salmonella typhimurium hasta la homogeneidad electroforética con una recuperación de 13,2 veces y 17,1 % mediante cromatografía hidrofóbica, de intercambio iónico y de permeación en gel utilizando Phenyl-Sepharose 6FF, DEAE-Sepharose CL-6B , y Sephadex G-75, respectivamente. Aplicando SDS-PAGE, el peso molecular se confirmó en 35 kDa. La temperatura, el pH y el punto isoeléctrico óptimos fueron 35 °C, 8,0, 5,6 ± 0,2, respectivamente. Se encontró que UcB5 tiene una amplia especificidad de sustrato contra casi todos los sustratos cromogénicos probados con una afinidad máxima contra N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA logrando Km de 0.16 mM, Kcat/Km de 3.01 × 105 S−1 M −1, y actividad amidolítica de 28,9 µmol min−1 L−1. Fue inhibido drásticamente por TLCK, PMSF, SBTI y aprotinina mientras que DTT, β-mercaptoetanol, 2,2′-bipiridina, o-fenantrolina, EDTA y EGTA no tuvieron efecto, lo que sugirió un tipo de serina proteasa. Además, ha mostrado una amplia especificidad de sustrato frente a una amplia gama de proteínas naturales, incluidas las proteínas séricas. Un estudio de citotoxicidad y microscopía electrónica reveló que UcB5 podría causar una proteólisis subcelular que finalmente condujo a una necrosis hepática. Por ello, la investigación futura debería centrarse en utilizar una combinación de antiproteasas externas y agentes antimicrobianos para el tratamiento de enfermedades microbianas en lugar de utilizar fármacos por sí solos.

Las toxinas y las enzimas actúan como agentes virulentos clave en la patogenia microbiana dentro de los huéspedes enfermos1,2. Las toxinas bacterianas están completamente caracterizadas y su papel en el proceso de patogénesis está bien estudiado, mientras que el papel de las proteasas microbianas en la patogénesis de animales y plantas no está bien estudiado. Esto podría ser el resultado de la complejidad de las enzimas y la falta de selectividad en comparación con las toxinas3. Las proteasas se han identificado hace mucho tiempo en los extractos celulares de muchas bacterias patógenas4. Puede ser una sorpresa saber que la mayoría de ellos no fueron identificados durante mucho tiempo y solo fueron definidos a fondo recientemente. Los microbios producen muchos tipos de proteasas clasificadas como serina, metalo, aspártico y cisteína. Algunos de ellos son inhibidos específicamente por los inhibidores de la proteasa plasmática conocidos como serpinas, mientras que la mayoría de ellos son resistentes o inactivan las antiproteasas plasmáticas humanas. Como resultado, una vez dentro, estos acelerarán el procesamiento de la enfermedad y el deterioro del huésped5.

Su participación en la virulencia se ha relacionado con una variedad de métodos. Para comenzar el proceso de invasión o digerir las proteínas del huésped para acceder a los nutrientes peptídicos, primero proteolizan y destruyen el tejido del huésped. Por ejemplo, al interferir con las proteínas de señalización celular o proteolizar las proteínas de los componentes de la matriz, la proteasa HtrA facilita primero la propagación de enfermedades. En segundo lugar, pueden activar toxinas de subunidades (toxinas AB) al dividir el resto activo (subunidad A) del resto de unión (subunidad B). En tercer lugar, algunas de ellas, como las proteasas Clp y Lon, actúan dentro del citosol directamente mediante la destrucción oportuna de los controladores de virulencia e indirectamente al proporcionar resistencia a los componentes antagonistas del interior, como los superóxidos y los radicales libres, para detener los componentes efectores inmunitarios del huésped contra la infección. patógeno bacteriano 6.

S. enterica con más de 2000 serovares puede causar muchas enfermedades diferentes. Serovar Enteritidis y Typhimurium son la causa más común de gastroenteritis en humanos, mientras que otros serovares como S. typhi son la causa fundamental de enfermedades sistémicas fatales. Curiosamente, los mutantes de serovariedad Typhimurium que carecen de las proteasas clpP o clpX resultan ser cepas no virulentas que indican la importancia de la proteasa ClpXP en la salmonelosis7. Además, los mutantes de serovariedad que carecen de la proteasa Lon son muy sensibles al H2O2 y la acidez, por lo que son incapaces de persistir dentro de los macrófagos y proliferar en partes distales del cuerpo para iniciar enfermedades8. Se encontró que la peptidasa N del serovar Typhimurium es la aminopeptidasa primaria dentro de los citosoles con una amplia gama de actividad de sustrato9.

En este momento, las infecciones causadas por los serovares de Salmonella siguen siendo peligrosas, especialmente en los países de bajos y medianos ingresos, donde pueden consumirse junto con muchos alimentos contaminados y provocar condiciones patológicas locales dentro del tracto alimentario, que pueden propagarse a un infección sistémica 10. Desafortunadamente, falta una caracterización detallada de las proteasas de Salmonella, por lo tanto, nuestra intención principal era monitorear las actividades proteolíticas y hemolíticas de los aislados de Salmonella y Shigella que acompañan a las muestras de alimentos locales. El objetivo de esta parte de la investigación se amplió para revelar las características enzimáticas y las alteraciones celulares de las células de mamíferos debidas a la proteasa UcB5 producida por el aislado más potente, S. typhimurium.

DTT, SBTI y EAM se obtuvieron de Merck (Beijing, China). Se obtuvieron fibrina, fibrinógeno, pNA, PMSF, DMSO, EGTA, PHMB, leupeptina y pepstatina A de Sigma-Aldrich (MO, EE. UU.). Sustratos sintéticos cromogénicos como D-Val-Leu-Arg-pNA (V6258), D-Val-Leu-Lys-pNA (V7127), D-Phe-Pip-Arg-pNA (P7027) y N-Succ-Ala -Ala-Pro-Phe-pNA (S7388) también se adquirieron de Sigma-Aldrich. La línea celular de adenocarcinoma humano HT29 se adquirió de Merck (Darmstadt, Alemania). Phenyl-Sepharose 6FF, DEAE-Sepharose CL-6B, Sephadex G-75 y las proteínas marcadoras se adquirieron de Amersham Biosciences (Suecia). El resto de los químicos eran de grado analítico de proveedores residentes.

La cepa bacteriana en estudio se recuperó originalmente de una muestra de hamburguesa de carne de res poco cocida que se compró en un mercado tradicional local. Esta cepa ha mostrado la mayor actividad proteolítica y hemolítica entre un total de catorce aislados bacterianos recuperados de diversas muestras de alimentos, incluidas carnes procesadas y productos lácteos. El aislamiento diferencial de estas bacterias se realizó en placas de agar Salmonella-Shigella (SS) (Himedia, India) suplementadas con leche descremada al 1% a pH 7,0. Posteriormente, las cajas se incubaron a 37 °C durante 48 h. Los halos despejados que rodean las colonias son indicativos de actividad proteolítica. Para el cribado de la actividad hemolítica, se utilizó agar SS suplementado con sangre de carnero citratada al 10 %. Las zonas de halo que rodeaban las colonias bacterianas eran indicativas de actividad hemolítica. Con base en este programa de detección, se seleccionó el aislamiento número cinco que se aisló de una muestra de hamburguesa de carne de res poco cocida y se identificó a nivel de especie utilizando la huella dactilar del gen 16SrDNA y se ejecutó el análisis BLAST en la base de datos GenBank. Los cultivos bacterianos a corto plazo se conservaron en agar nutritivo a 4 °C, mientras que los cultivos a largo plazo se conservaron a -80 °C en caldo glicerado al 20 % (v/v).

Los inóculos de la cepa número UcB5 se subcultivaron regularmente en caldo LB que consistía en (g/L) NaCl 5,0, extracto de levadura 5,0 y triptona 10,0 con pH 7,0. Exactamente, el uno por ciento (v/v) del inóculo de 12 h de antigüedad (~ 3 × 108 ufc/ml) se transportó al caldo de fermentación a pH 7,0. El medio basal consistía en (p/v) 1 % de fructosa, 0,5 % de NaCl, 0,5 % de peptona, 0,15 % de MgSO4·7H2O, 0,08 % de KH2PO4, 0,02 % de K2HPO4, 0,005 % de CuSO4 y 0,001 % de FeSO4. La incubación se realizó a una velocidad de agitación de 150 revoluciones por minuto a 37 °C durante 48 h en matraces Erlenmeyer de 250 mL con 50 mL de caldo.

La actividad proteolítica se evaluó mezclando 1 mL de sobrenadante de cultivo y 1 mL de solución de azocaseína al 1% (p/v) disuelta en tampón Tris-HCl 0,2 M de pH 7,0. Se permitió que la reacción enzima-sustrato prosiguiera durante 30 min a 37 °C y se finalizó mediante la adición de 2 ml de una solución de ácido tricloroacético al 10 % (p/v). A continuación, incubación durante 60 min en un baño de hielo triturado. La cantidad de proteínas de degradación solubles (C) se midió (mg/mL) siguiendo este cálculo; C (mg/ml) = 1,55 DO280 − 0,76 DO260. Una unidad (1 U) de actividad enzimática proteolítica era equivalente a un microgramo de l-tirosina liberada por mililitro por minuto de reacción en las condiciones estándar de experimentación.

La proteasa cruda se purificó con enfriamiento a 4 °C a través de cuatro etapas que comprenden precipitación de sal de (NH4)2SO4, cromatografía hidrofóbica en fenil-sefarosa 6FF, cromatografía de intercambio aniónico en DEAE-Sefarosa CL-6B y cromatografía de permeación en gel Sephadex G-75. Inicialmente, el caldo de cultivo se centrifugó a 7000 × g durante 10 min, luego se realizó la adición de (NH4) 2SO4 al 30-70% de saturación. Centrifugación a una velocidad de 10.000xg durante 15 min para recolectar las proteínas solubles. La proteasa cruda peletizada y otras proteínas se resuspendieron luego a pH 7,8 en tampón A (Tris-HCl 20 mM que comprende NH4)2SO4 1,0 M. Tras la eliminación de la materia en suspensión y la etapa de diálisis, la proteasa bruta concentrada se cargó en una columna Phenyl Sepharose 6 FF de 1,5 × 20 cm2 de dimensión. A partir de entonces, se aplicó un ascenso lineal de 0,5–0,0 M (NH4)2SO4 en el tampón A para la elución de las proteínas. A partir de este cromatograma de elución, se agruparon y concentraron las fracciones activas que mostraban actividad enzimática. Desde allí, se cargó en la siguiente columna que comprende DEAE-Sepharose CL-6B con una dimensión de 1,5 × 15 cm2. La elución se realizó a un caudal de 0,5 ml/min a pH 9,4 con tampón Tris-HCl 20 mM (tampón B). A continuación, las fracciones activas que mostraban actividad proteolítica se concentraron, se dializaron con tampón B y se cargaron en la siguiente columna que comprendía Sephadex G-75 FF con una dimensión de 1,5 × 30 cm2. La elución se realizó con el tampón A. Las fracciones activas en proteasa finales se liofilizaron y se realizó SDS-PAGE mediante la técnica universal de Laemmli11 utilizando gel de separación al 15 % (p/v) y gel de apilamiento al 5 % (p/v).

El impacto de la temperatura en la actividad enzimática se examinó entre 20 y 65 °C utilizando azocaseína al 1 % (p/v) en tampón Tris-HCl 0,2 M, pH 7,0. Por otro lado, para estudiar la estabilidad térmica, una solución de proteasa probada en Tris-HCl 0,2 M (pH 7,0) se dejó reposar entre 20 y 65 °C durante 60 min. Al final de la incubación, los tratamientos se enfriaron para la determinación de la actividad de proteasa remanente en los ajustes típicos del ensayo enzimático.

Para estudiar el impacto del pH en la actividad proteolítica de UcB5, las soluciones de reacción se fijaron en una amplia gama de pH mediante tres tampones. Tampón de citrato-fosfato para lograr un rango de pH de 3,0 a 6,0, tampón Tris-HCl para pH de 7,0 a 8,0 y tampón de glicina-NaOH para ajustar pH de 9,0 a 13,0. Se utilizó azocaseína al 1% (p/v) de concentración y la incubación de las reacciones enzima-sustrato se realizó a 35 °C.

Para estudiar la estabilidad del pH de la enzima pura, se incubó durante 60 min a 35 °C con varios pH en el rango de 5,0 a 13,0 usando los tampones prescritos. La actividad enzimática restante se evaluó a pH 8,0. Además, el punto isoeléctrico de la proteasa analizada se determinó mediante la incubación durante la noche de una preparación concentrada de la enzima pura a pH en el rango de 3,0 a 11,0 a 4 °C. La precipitación de proteínas se realizó a la fuerza gravitatoria de 10.000 × g durante 15 min. Los sedimentos de proteína se cuantificaron según el método de Bradford12. El punto isoeléctrico se expresó como el grado de pH en el que se ha producido la máxima precipitación de proteínas13.

Estos se determinaron colorimétricamente frente a varios péptidos cromogénicos como sustratos sintéticos, como P7021, V7127, S7388 y V6258. Para la experimentación, cada pocillo de una microplaca se cargó con 5 µl de solución enzimática en tampón Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) y 100 µl de un sustrato sintético a una concentración específica de 0,02 a 0,15 mM. La reacción se realizó a 37 °C y se terminó a intervalos de tiempo mediante la adición de 1,4 ml de ácido tricloroacético 0,15 M. La cantidad de pNA liberado se estimó espectrofotométricamente a A405 nm. Una unidad (1 U) de actividad amidolítica de proteasa se calibró a nmol del sustrato cromogénico degradado por minuto por ml debido a la acción de la proteasa ensayada. Los parámetros cinéticos se estimaron a partir de los gráficos de Lineweaver-Burk en función de la velocidad inicial de la reacción enzimática.

Para definir el grupo al que pertenece la UcB5 purificada, se exploró la influencia de varios iones metálicos y reactivos estándar sobre su actividad amidolítica. En una microplaca, estos se mezclaron con 1,0 × 10–4 mg del sustrato cromogénico S7388 y 2,0 × 10–3 mg de la enzima en 100 µl de tampón Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) y se incubaron durante 3 min a 37ºC. ºC El pNA liberado se cuantificó mediante la medición espectrofotométrica en A405.

Para la experimentación con iones metálicos, se probaron en pruebas paralelas a la concentración de 5 mM. Las concentraciones aplicadas de reactivos de proteasa variaron de acuerdo con la literatura citada (ver los resultados). La actividad enzimática en el tratamiento desprovisto de reactivos y cationes se consideró del 100%.

La especificidad de sustrato de UcB5 frente a sustratos proteicos naturales se estudió a una concentración del 0,5 % (p/v) siguiendo el procedimiento de Peng et al.14. Estos incluyen caseína, elastina, hemoglobina, fibrina, gelatina, fibrinógeno, colágeno, mucina, IgG y albúmina sérica. Esto se determinó frente a varias proteínas naturales. Una unidad (1 U) de actividad proteolítica se calibró como la cantidad de enzima que libera el aminoácido tirosina comparable a 1 µmol por mililitro por minuto en las condiciones estándar del ensayo.

Los siguientes experimentos fueron aprobados por una institución apropiada. Además de esto, todos los métodos se realizaron siguiendo las pautas y regulaciones pertinentes, incluidas las pautas ARRIVE. La actividad anticoagulante in vitro se examinó como el aumento del período de coagulación del suero sanguíneo humano en presencia de 15 µg de proteasa UcB5/ml15. Exactamente, se agitaron 100 µl de suero sanguíneo con volúmenes equivalentes de cada tromboplastina y caolín. Después de 2 min de incubación a 37 °C en un baño de agua, se añadieron exactamente 100 µl de CaCl2 al 0,3 % (p/v) y 100 µl de la enzima. A continuación, se determinó el tiempo de coagulación en presencia de la enzima en comparación con blancos que contenían una cantidad equivalente de solución salina fisiológica en lugar de la enzima purificada.

El ensayo de citotoxicidad in vitro de la proteasa purificada de S. typhimurium frente a la línea celular de adenocarcinoma humano HT29 (Merck, Darmstadt, Alemania) se realizó en una placa de 96 pocillos mediante incubación durante 24 h. Por 1 x 105 células HT29 por mililitro, se usaron quince microgramos de la enzima. Al final de la incubación, el porcentaje de muerte celular de HT29 se evaluó mediante el ensayo MTT estándar16. Para los blancos negativos, se utilizó solución salina fisiológica en lugar de las preparaciones de proteasa activa, mientras que para los blancos se utilizó un medio sin células. La idea de este ensayo es que las células supervivientes restantes puedan convertir el reactivo MTT de tetrazolio amarillo en el complejo de formazán púrpura con una absorción característica a A540 nm, lo que indica la viabilidad de HT29. La intensidad del color púrpura está en relación directa con el número de células supervivientes tras la exposición a la UcB5.

Además, se realizó un ensayo de actividad dañina para las células contra los glóbulos rojos (actividad hemolítica) debido a la enzima purificada. Esto se logró agitando en vórtex tamaños de volumen idénticos de 15 µg de proteasa/mL y glóbulos rojos humanos lavados al 4 % (v/v) suspendidos en tampón de borato 0,1 M, pH 7,5. La incubación se realizó a 37 °C durante 90 min, posteriormente se midió colorimétricamente la cantidad de hemoglobina liberada. A modo de comparación, se realizó un tratamiento de hemólisis completo mezclando una suspensión de glóbulos rojos con una solución de Triton X-100 al 1 % (v/v).

Además, se realizó un cribado in vivo de la actividad dañina para las células y se calculó el valor LD50. Para ello, ratones BALB/c que pesaban entre 22 y 25 g se aclimataron a las condiciones del laboratorio durante una semana y se mantuvieron en condiciones físicas y nutricionales relativamente fijas. Luego se dividieron en seis grupos de seis por jaula. El primer grupo se representó como el grupo en blanco universal. Los ratones de este grupo se inocularon por vía intraperitoneal con un volumen igual de una preparación de enzima desnaturalizada por calor a una concentración de 60 µg/peso corporal. Mientras que a los otros cinco grupos se les inyectó por vía intraperitoneal la preparación de proteasa activa a diversas concentraciones (60, 30, 15, 8 y 4 µg de proteasa/peso corporal) en un volumen total de 1 ml de solución. Luego se observaron los animales a intervalos de tiempo durante 48 h para el cálculo de la DL50 según el método de Karber. Los hígados de los ratones afectados y en blanco se extrajeron inmediatamente después de la muerte y se fijaron en glutaraldehído al 5 % (v/v) y luego en una solución de OsO4 al 1 % (p/v). Antes de la disección de un ratón en blanco, se anestesió con el gas inhalante sevoflurano. Se cortaron secciones ultrafinas de 70 nm con un ultramicrótomo RMC y se cargaron en rejillas de soporte TEM de grado estándar hechas de cobre para su examen bajo JEOL 1010 TEM.

Todas las mediciones y tratamientos se realizaron por triplicado a menos que se indique lo contrario. El análisis estadístico se realizó con el software SPSS Statistics V24. Las lecturas finales se representaron en forma de promedios ± desviaciones estándar.

El estudio in vivo se realizó con el permiso n.° 5/2019EC del Comité de Ética para el Cuidado de Animales Experimentales de la Universidad de Kafrelsheikh, Egipto. Además de esto, todos los métodos se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones relevantes, incluidas las pautas ARRIVE.

Durante un estudio preliminar de aislamientos de Salmonella y/o Shigella que ejercían actividad proteolítica y hemolítica, aislamos un total de catorce aislamientos en agar SS suplementado con leche descremada. Estos se obtuvieron originalmente de treinta muestras de alimentos recolectadas en algunos mercados locales. El productor más potente entre ellos fue el aislado número cinco, que se aisló de una muestra de hamburguesa de carne de res poco cocida. Por lo tanto, se designó como cepa UcB5. Los datos de secuenciación del gen 16SrDNA y el análisis BLAST indicaron que la cepa UcB5 era S. typhimurium con un 98,86 % de identidad similar con un género y una especie existentes. La secuencia de nucleótidos se incluyó en la biblioteca de registros GenBank con el número de acceso (MH340533.1).

El crecimiento bacteriano y la producción de proteasa UcB5 de la cepa más potente se sincronizaron durante todo el período de fermentación (96 h). Alcanzaron los niveles máximos a las 48 h de incubación donde el crecimiento bacteriano alcanzó una densidad óptica de 1,32 a una longitud de onda de 600 nm y la productividad enzimática alcanzó 125,2 U/mL (Fig. 1).

Relación de la producción de proteasa (-■-) y la fase de crecimiento (-○-) en un cultivo de S. typhimurium cultivado en un medio basal compuesto por (p/v) 1% de fructosa, 0,5% de peptona, 0,5% de NaCl, 0,15% MgSO4·7H2O, 0,08% KH2PO4, 0,02% K2HPO4, 0,005% CuSO4 y 0,001% FeSO4. La fermentación se realizó en zaranda rotatoria a una velocidad de 150 rpm a 37 °C y un pH inicial de 7.0 por 48 h. Existe una correlación altamente positiva entre el crecimiento bacteriano y la productividad enzimática ya que el coeficiente de correlación r = 0,886***. El valor P de dos colas se da como 0,00, lo que produce una correlación lineal muy significativa.

Como se indica en la Tabla 1, la enzima UcB5 se purificó de manera eficiente hasta la homogeneidad electroforética a partir de cultivos líquidos de S. typhimurium a través de varios pasos que incluyen cromatografía hidrofóbica, de intercambio iónico y de filtración en gel mediante Phenyl-Sepharose 6FF, DEAE-Sepharose CL-6B y Sephadex G-75, respectivamente. La actividad específica final de la enzima se incrementó hasta el doble de 13,2 × y la recuperación del 17,1%. La homogeneidad electroforética de la enzima analizada se reflejó en el pico principal de actividad de la proteasa que involucraba las fracciones 18–42 obtenidas en el último paso cromatográfico. Después de concentrar estas fracciones, se realizó SDS-PAGE (Fig. 2a) donde mostró una banda prominente a 35 kDa (Fig. 2b). La versión anterior del gel SDS-PAGE se presenta en la figura complementaria S1.

Perfil de elución de UcB5 a través de Sephadex G-75 (a) y SDS-PAGE (b). Inicialmente, las proteínas del cultivo se precipitaron con sulfato de amonio a concentraciones del 30 % al 70 % y luego se cargaron en una columna Phenyl Sepharose 6FF (1,5 × 20 cm2) seguida de una columna DEAE-Sepharose CL-6B (1,5 × 20 cm2). y una columna Sephadex G-75 FF (2,5 × 100 cm2). Finalmente, el análisis SDS-PAGE se realizó utilizando gel de apilamiento al 5 % (p/v) y gel de separación al 15 % (p/v). El gel se recorta con software de pintura y la versión anterior del gel se encuentra en el archivo de información complementaria.

La mejor temperatura de reacción para la actividad proteolítica de UcB5 frente al sustrato azocaseína se detectó a 35 °C (Fig. 3). Además, la enzima fue térmicamente estable por debajo de 55 °C durante 60 min. Retuvo el 84% de su actividad inicial a 50 °C. El pH ideal para la actividad proteolítica de UcB5 frente al sustrato se estableció en pH 8,0 (Fig. 4a). Además, la estabilidad del pH de UcB5 se encontró entre 8,0 y 11,0 durante 60 min (Fig. 4a). A un pH de 8,0 a 11,0, la enzima retuvo el 92 % de su actividad original. Como se refleja en la precipitación de proteínas, el punto isoeléctrico de la estructura proteica de esta enzima se encontró a pH 5,6 ± 0,2. El nivel de precipitación alcanzó 1,8 mg proteína/mL (Fig. 4b).

Impacto de la temperatura tanto en la actividad proteolítica (-●-) como en la estabilidad (-○-). El impacto de la temperatura sobre la actividad enzimática se probó a pH 7,0 con tampón Tris-HCl 0,2 M utilizando el sustrato azocaseína. La estabilidad a la temperatura de la UcB5 se estudió mediante su incubación sin sustrato en Tris-HCl 0,2 M (pH 7,0) durante 60 min. Al final de la incubación, se evaluó la actividad restante. Existe una correlación altamente positiva entre la actividad enzimática y su estabilidad térmica ya que el coeficiente de correlación r = 0.738**. El valor P de dos colas se da como 0.015, lo que produce una correlación lineal altamente significativa. Si bien existe una correlación muy negativa entre la estabilidad de la enzima y la temperatura, se elimina del coeficiente de correlación r = − 0,915***. El valor P de dos colas se da como 0,000, lo que produce una correlación lineal muy significativa. La ecuación de regresión estimada se puede expresar como estabilidad enzimática = 139,9–1,47 temperatura.

Impacto del pH tanto en la actividad proteolítica (-●-) como en la estabilidad (-○-) (a). La temperatura de reacción se ajustó a 35 °C en presencia de azocaseína. La estabilidad del pH de la enzima pura se inspeccionó mediante su incubación sin sustrato a 35 °C durante 60 min con varios pH, luego se evaluó la actividad enzimática remanente a un valor de pH de 8.0. El pH isoeléctrico basado en el patrón de precipitación de proteínas se muestra en (b). Existe una débil correlación positiva entre la actividad enzimática y su estabilidad de pH ya que el coeficiente de correlación r = 0,487. El valor P de dos colas se da como 0.109. Existe una débil correlación negativa entre el pH y la proteína precipitada ya que el coeficiente de correlación r = − 556***. El valor P de dos colas se da como 0,000 y la ecuación de regresión estimada se puede expresar como contenido de proteína = 1,522–0,122 pH.

Nuestros resultados indicaron que la enzima ha mostrado diferentes grados de actividad amidolítica frente a los sustratos cromogénicos probados (Tabla 2). El sustrato de proteasa estándar para las proteasas de quimotripsina y subtilisina, N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, fue el sustrato más degradado por UcB5 y mostró una actividad amidolítica de 28,9 µmol min−1 L−1. Además, la UcB5 ha degradado el sustrato cromogénico D-Val-Leu-Lys-pNA y D-Phe-Pip-Arg-pNA. Sin embargo, ha mostrado la acción más baja contra D-Val-Leu-Arg-pNA. Los parámetros cinéticos para la UcB5 frente al sustrato N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA fueron; Km de 0,16 mM y Kcat/Km de 301 mM−1 S−1.

El estudio del efecto de los reactivos de proteasa y los cationes sobre la actividad enzimática (Tabla 3) ofrece una comprensión inicial de la naturaleza de la enzima analizada, la naturaleza del sitio activo y los suministros de cofactores. Durante la investigación del impacto de los cationes sobre la actividad amidolítica, se encontró que ninguno de ellos era un activador de la enzima. La actividad amidolítica en ausencia de metales se consideró del 100%, por lo tanto, la actividad relativa fue del 92% para Ba2+, 87% para Co2+, 62% para Zn2+, 102% para Fe3+, 84% para Ca2+, 98% para Mg2+, 65 % para Cu2+, 49% para Mn2+, 67% para Cd2+, 103% para Ag2+ y 47% para iones Hg2+.

Con respecto al impacto de los reactivos de proteasa, se encontró que la actividad proteasa de UcB5 fue inhibida por TLCK (1,2 % de actividad relativa), PMSF (17,3 % de actividad relativa), SBTI (31,3 % de actividad relativa), aprotinina (3,0 % de actividad relativa) , pepstatina A (15,7 % de actividad relativa) y leupeptina (78,5 % de actividad relativa), pero no se vio influida por 2,2′-bipiridina (102,2 % de actividad relativa), DTT (100,5 % de actividad relativa), o-fenantrolina (99,5 % de actividad relativa). actividad relativa), β-mercaptoetanol (98,9 % de actividad relativa) y los dos inhibidores de metaloproteasas EDTA (100,1 % de actividad relativa) y EGTA (100,2 % de actividad relativa) (Tabla 2). Además, nuestros resultados indicaron que los agentes formadores de mercaptidas PHMB (99,7 % de actividad relativa) y EAM (102,1 % de actividad relativa) no influyeron en la actividad proteolítica.

Esto se determinó frente a varias proteínas naturales a una concentración del 0,5 % (p/v). Considerando que la actividad de la UcB5 frente a la caseína fue del 100%, las actividades relativas frente a fibrina, gelatina, mucina, hemoglobina, fibrinógeno, elastina, colágeno, IgG y albúmina sérica fueron 32,0, 65,6, 6,8, 23,8, 76,3, 11,2, 42,5, 0,0 y 12,7%, respectivamente. La acción proteolítica contra las proteínas plasmáticas también se confirmó durante el siguiente experimento durante la prueba de su actividad anticoagulante (Tabla complementaria S1). En presencia de UcB5, el tiempo de coagulación del suero sanguíneo se prolongó hasta 81 s, lo que representa 3,5 veces el tiempo de coagulación sin enzima.

Durante el experimento in vitro presentado en la Tabla complementaria S1, UcB5 a una dosis de 15 µg de enzima/ml mostró una muerte celular del 63,8 % de la línea celular HT29 cultivada. Además, provocó un aumento de 3,9 veces en la hemólisis de los glóbulos rojos. Además, se realizó un estudio comparativo in vivo con una preparación de proteasa activa y una inactivada por calor en un intento de determinar si existe una relación entre su toxicidad y la actividad enzimática. Las preparaciones activas se emplearon de 60 µg a 4 µg de proteasa/peso corporal del ratón (Tabla complementaria S2). A concentraciones de 60 µg y 30 µg, se produjo la muerte de todos los animales analizados en 2 h, mientras que 4 y 1 de cada seis ratones murieron en 48 h con tratamientos de 15 µg y 8 µg, respectivamente. No se observó letalidad con 4 µg de tratamiento de la enzima. Por otro lado, ninguno de los ratones murió por la preparación de enzima inactivada por calor. La LD50 calculada a las 48 h fue de 15,75 µg de proteasa/peso corporal del ratón (Tabla complementaria S2).

El estudio TEM en los ratones afectados reveló que UcB5 indujo vesiculación (V) dentro de los hepatocitos y la membrana nuclear (nm) se deformó con la acumulación de heterocromatina (Hc). La membrana celular y el retículo endoplásmico rugoso (ER) de los hepatocitos desaparecieron por completo (Fig. 5).

Micrografías TEM que muestran los cambios ultraestructurales en los hepatocitos de los ratones tratados y de control. (a) Un hepatocito típico muestra una membrana celular intacta (cm) y una membrana nuclear intacta (nm) que contiene eucromatina (Ec). Además, muestra un retículo endoplásmico rugoso (RE) intacto y mitocondrias normales extensas (M). (b) Una célula hepática de un ratón que ha recibido una preparación activa de proteasa UcB5. Muestra vesiculación (V) y membrana nuclear malformada (nm) con heterocromatina (Hc). Muestra la desaparición de la membrana celular y del retículo endoplásmico rugoso. La actividad de daño celular in vivo se evaluó experimentando con ratones BALB/c alojados en seis grupos. Brevemente, se inoculó un UcB5 purificado en un volumen total de 1 ml en cada ratón por vía intraperitoneal. Cada ratón se inoculó con una preparación de enzimas inactivadas por calor para el grupo de control universal. Se extrajeron los hígados de los animales sacrificados y de control y se fijaron. Finalmente, se tomaron secciones ultrafinas de 70 nm de espesor con un ultramicrótomo RMC y se apoyaron en rejillas de cobre para su examen al microscopio electrónico bajo JEOL 1010 TEM.

La capacidad de los microorganismos patógenos para causar enfermedades depende del desarrollo de proteasas extracelulares, según varias investigaciones publicadas. Aunque el método de acción preciso no está claro, parece que estas enzimas microbianas interfieren con el sistema de proteasas del huésped17. En nuestros estudios anteriores, informamos la patogenia de la proteasa KB76 de Brevibacterium otitidis18 y la proteasa ZuhP13 de Pseudomonas aeruginosa17. En este trabajo, hemos separado y caracterizado una posible enzima citotóxica denominada proteasa UcB5 de la bacteria S. typhimurium.

La cepa productora de proteasa más eficaz, la cepa UcB5, fue identificada por los datos de secuenciación del gen 16S rDNA como S. typhimurium. Después de 48 h de incubación, la producción de proteasa UcB5 (125 U/mL) y el crecimiento bacteriano se sincronizaron al más alto nivel (Fig. 1). Por lo tanto, se puede inferir que la proteasa UcB5, al igual que la proteasa ZuhP13 de P. aeruginosa, es una enzima principal requerida para el desarrollo bacteriano17. Contrariamente a la proteasa del patógeno de peces, Yersinia ruckeri ha demostrado el mejor rango de productividad a las 12 h19. Curiosamente, la UcB5 se produjo en un medio basal desprovisto del sustrato caseína (ver materiales y métodos), lo que es una indicación de una enzima constitutiva, no inducible.

La actividad específica final de la enzima aislada aumentó 13,2 veces, con una recuperación del 17,1%. SDS-PAGE de las proteínas de la última columna (Fig. 2a) reveló una banda distinta a 35 kDa (Fig. 2b). Esta masa molecular coincide con las proteasas patológicas de P. aeruginosa20 mientras que, a diferencia de las proteasas de Legionella pneumophila (38 kDa21), Vibrio pelagius (39 kDa22) Vibrio parahaemolyticus (43 kDa23), Br. otitidis (47 kDa18) y Y. ruckeri (47 kDa19).

Con un parecido con la proteasa virulenta de Y. ruckeri19, se demostró que 35 °C era la temperatura de reacción óptima para la actividad proteolítica de UcB5 (Fig. 3). Mientras que 40 °C fue lo mejor para la proteasa ZuhP1317, y 50 °C fue lo mejor para la proteasa ME424. Además, se encontró que UcB5 era termoestable por debajo de 55 °C durante 60 min (Fig. 3). En referencia a la literatura, es más termoestable en evaluación con la proteasa virulenta de Y. ruckeri (inhibición completa a 55 °C19) y más termoestable en comparación con la proteasa san-ai de P. aeruginosa (estable a 60 °C para 90 min25.

Se demostró que la actividad proteolítica de UcB5 es mejor a pH 8,0 (Fig. 4a), que es similar a las proteasas patológicas de Y. ruckeri19, Bacillus cereus cepa BG126 y cepa KCTC 367427. La mayor disminución en la actividad proteolítica a pH más bajo valores pueden deberse a que los valores de pH más bajos coinciden con el punto isoeléctrico (pI, 5.6 ± 0.2, Fig. 4b). La proteasa KB76 de Br. Otros investigadores también informaron que otitidis18 y la proteasa que daña la córnea de una cepa de P. aeruginosa4 tienen IP similares. Además, la estabilidad del pH de la proteasa UcB5 se encontró entre 8 y 11 durante 60 min (Fig. 4a) similar a la proteasa de Aeromonas veronii PG0128 en oposición a la proteasa ZuhP1317 y la proteasa ME4 de P. aeruginosa24 que eran estables a pH 6 –9 durante 60 min.

Frente a los sustratos cromogénicos investigados, la enzima mostró diversos grados de actividad amidolítica (Tabla 2). El sustrato de proteasa estándar para las proteasas de quimotripsina y subtilisina, N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, fue el sustrato más degradado por UcB5 y mostró una actividad amidolítica de 28,9 µmol min−1 L−1. Además, la UcB5 degradó el sustrato cromogénico D-Val-Leu-Lys-pNA, que es el sustrato estándar de las proteasas de plasmina, y D-Phe-Pip-Arg-pNA, que es el sustrato de las proteasas de trombina. Sin embargo, la enzima demostró la menor actividad contra D-Val-Leu-Arg-pNA, el sustrato cromogénico de los tipos de proteasas de calicreína. A partir de estos hallazgos, podemos concluir que UcB5 es similar a la subtilisina o la quimotripsina porque hidroliza los enlaces Lys-péptido más fácilmente que los enlaces Arg-péptido. Curiosamente, la subtilisina UcB5 atacó a la D-Phe-Pip-Arg-pNA con más eficacia que la D-Val-Leu-Arg-pNA como la subtilisina FS33 proteasa29 que la diferencia de otras subtilisinas.

Los valores cinéticos de UcB5 frente al sustrato N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA fueron; Km de 0,16 mM y Kcat/Km de 301 mM−1 S−1. En cuanto a otras subtilisinas, ZuhP13 de P. aeruginosa mostró una eficacia catalítica de 4,62 × 107 M-1 S-1 con Kcat de 1,27 S-117. La eficacia catalítica de ZapA de Proteus mirabilis N17-12 contra Phe-Ser fue 291 mM-1 S-1, Km fue 13,6 µM y Kcat fue 3,96 S-1 mientras que la eficacia catalítica contra Phe-Leu fue 13 mM-1 S−1, Km era 2,3 µM y Kcat era 0,03 S−130.

Durante el examen del efecto de los cationes sobre la actividad amidolítica, ninguno de los cationes fue un activador enzimático. Al considerar los efectos de los reactivos de proteasa, se encontró que 2,2'-bipiridina, DTT, o-fenantrolina, β-mercaptoetanol y los dos inhibidores de metaloproteasa (EDTA y EGTA) no afectaron la actividad de UcB5 (Tabla 2 ). Además, los agentes formadores de mercaptidas (PHMB y EAM) no afectaron la actividad proteolítica. En consecuencia, proponemos que los grupos triptófano (indol) y serina (hidroxi) estén ubicados en o cerca del centro activo de UcB5. Combinando nuestros hallazgos, proponemos que UcB5 pertenece a las serina proteasas similares a la proteasa virulenta espP de E. coli31. Con referencia a la literatura, notamos que las serina proteasas virulentas son raras en comparación con las metaloproteasas virulentas. Este último tipo fue descubierto en los extractos de Y. ruckeri19, P. mirabilis N17-1230 y casi todas las cepas de P. aeruginosa24,25.

La actividad relativa de UcB5 frente a fibrina, gelatina, mucina, hemoglobina, fibrinógeno, elastina, colágeno, IgG y albúmina sérica fue del 32,0, 65,6, 6,8, 23,8, 76,3, 11,2, 42,5, 0,0 y 12,7 %, respectivamente. La desproteólisis de la inmunoglobulina tipo G puede ser prometedora en la producción de proteínas quiméricas a partir de UcB5 e IgG para dirigirse a células no deseadas específicas. El experimento posterior, que evaluó las propiedades anticoagulantes de la enzima, validó aún más la acción proteolítica contra las proteínas plasmáticas (Tabla complementaria S1). En presencia de UcB5, el tiempo de coagulación de la sangre se prolongó hasta 81 s, lo que representa 3,5 veces el tiempo de coagulación sin enzima. La capacidad de UcB5 para destruir la fibrina y el fibrinógeno respalda la idea de que las proteasas microbianas facilitan la translocación bacteriana dentro del cuerpo. Como resultado, estamos a favor de utilizar un inhibidor de la proteasa adecuado junto con antibióticos en lugar de solo antibióticos para tratar infecciones bacterianas dentro del cuerpo humano32.

Durante el experimento in vitro descrito en la Tabla complementaria S1, UcB5 mostró una muerte celular del 63,8% de la línea celular HT29 cultivada. Además, provocó un aumento de 3,9 veces en la hemólisis de los glóbulos rojos. Como resultado, la desintegración de la membrana celular y de los glóbulos rojos parece ser una fase en el modo de acción de UcB5. Cuando esto sucedió, la enzima comenzó a reaccionar con la hemoglobina y otras proteínas internas importantes. Esta característica de la UcB5 podría ser la causa de la hemorragia que se observó en las cavidades internas del tórax y el abdomen de los animales disecados. Las actividades hemolíticas y hemorrágicas presentadas de la UcB5 coinciden con la proteasa A de V. parahemolyticus no. 9323 y ZuhP13 proteasa de P. aeruginosa17.

Tras la inyección de UcB5 en ratones, se produjo formación de vesículas (V) dentro de los hepatocitos y las membranas nucleares (nm) se deformaron debido a la acumulación de heterocromatina (Hc). Además, TEM reveló que la membrana celular y el retículo endoplásmico rugoso (RE) de los hepatocitos habían desaparecido por completo (Fig. 5). La lisis celular y nuclear causada por UcB5 puede deberse a necrosis, no apoptosis, ya que no hay deterioro de las configuraciones mitocondriales (M). En cuanto a las proteasas patológicas citadas, Pseudoalteromonas sp. Las proteasas N10 y V. vulnificus generaron un deterioro de las proteínas musculares y exhibieron necrosis profunda de la herida, respectivamente33. Los peces experimentaron un daño celular significativo debido a la proteasa de Y. ruckeri19. Por otro lado, los investigadores han demostrado que las proteasas de los estreptococos inducían tanto la fascitis necrosante como la apoptosis celular de los tejidos del huésped34.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

dietilaminoetilo

Dimetilsulfóxido

1,4-ditiotreitol

Acetimidato de etilo de aminobenzamidina

Ácido etilendiaminotetraacético

Ácido etilenglicotetraacético

Inmunoglobulina clase G

Luria-Caldo de cultivo

Reactivo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio

Biguanida de polihexametileno

Punto isoeléctrico

fluoruro de fenilmetilsulfonilo

P-nitroanilina

Inhibidor de tripsina de soja

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

Agar Salmonella Shigella

Microscopio electrónico de transmisión

Tosil-l-lisina clorometilcetona

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Los autores extienden su agradecimiento al Vicerrectorado de Investigación e Innovación del Ministerio de Educación de Arabia Saudita por financiar este trabajo de investigación a través del proyecto número IF-2020-028-BASRC en la Universidad Imam Abdulrahman bin Faisal (IAU)/Centro de Investigación Científica Básica y Aplicada (BASR).

Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Imam Abdulrahman Bin Faisal (IAU), PO Box 1982, Dammam, 31441, Arabia Saudita

Essam Kotb, Haifa A. Alqahtani, Hussah A. Al-shwyeh, Sakina M. Algarudi y Hanan Almahasheer

Centro de Investigación Científica Básica y Aplicada, Universidad Imam Abdulrahman Bin Faisal, PO Box 1982, Dammam, 31441, Arabia Saudita

Essam Kotb, Hussah A. Al-shwyeh y Sakina M. Algarudi

Departamento de Botánica y Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de Kafrelsheikh, Kafrelsheikh, 33516, Egipto

Baher A. El-Nogoumy

Departamento de Estadística, Facultad de Comercio, Universidad Al-Azhar (Sucursal de Niñas), PO Box 11751, El Cairo, Egipto

Asmaa A. Ahmed

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EK llevó a cabo el diseño del estudio y estudios enzimológicos. BAE llevó a cabo la caracterización bacteriana y el estudio in vivo. HAA ayudó en el estudio in vivo. AAA realizó el análisis estadístico y el trabajo de software, incluida la determinación de los datos. HAAl. ayudó en los estudios enzimológicos. SMA ayudó en la recolección de muestras y el trabajo de software. HA ayudó en el muestreo ambiental y la edición del manuscrito. Todos los autores han ayudado a redactar el manuscrito y aprobaron la forma final.

Correspondencia a Essam Kotb.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Kotb, E., El-Nogoumy, BA, Alqahtani, HA et al. Una proteasa de serina citotóxica putativa de Salmonella typhimurium UcB5 recuperada de una hamburguesa poco cocinada. Informe científico 13, 3926 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29847-8

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Recibido: 19 Septiembre 2022

Aceptado: 10 febrero 2023

Publicado: 09 marzo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29847-8

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